Высокопроизводительный скрининг с помощью оптического SPR-биосенсора низкомолекулярных соединений на взаимодействие с CYP51 Candida krusei

The opportunistic fungus Candida krusei is the causative agent of nosocomial infections characterized by high mortality and development of resistance to drugs of the azole class. Therefore, develjoment of non-azole antifungal agents against resistant fungal strains is extremly important. Lanosterol 14-alpha demethylase (CYP51) is a well-known antifungal target. The optical SPR biosensor is a universal tool for screening studies in search of new drug prototypes. This paper presents the methodological aspects of high-hroughput SPR based screening of a library of low molecular weight compounds of natural origin for their interaction with C. krusei CYP51. It has been shown that when performing high-throughput screening, a researcher should pay special attention to the degree of a sensorgram curvature in the association phase. The described approaches to the analysis of high throughput screening data can be useful for researchers working with SPR biosensors from various manufacturers.Условно-патогенный гриб Candida krusei (C. krusei) является возбудителем нозокомиальных инфекций, характеризующихся высокой летальностью. В последнее время наблюдается тенденция к увеличению доли штаммов дрожжевых грибов, резистентных к препаратам класса азолов. Поэтому поиск потенциальных противогрибковых соединений неазольной природы является актуальным направлением исследований при разработке новых эффективных терапевтических средств в отношении резистентных штаммов грибов. Ланостерол 14-альфа деметилаза (CYP51) является широко известной мишенью для противогрибковых средств. Оптические SPR-биосенсоры представляют собой универсальный инструмент для скрининговых исследований, целью которых является поиск прототипов новых лекарственных соединений. В данной работе представлены методические аспекты высокопроизводительного скрининга библиотеки низкомолекулярных соединений природного происхождения, направленного на установление их взаимодействия с CYP51 C. krusei с использованием SPR-биосенсора. Как показывают результаты, при проведении высокопроизводительного скрининга особое внимание следует обращать на степень выраженности наклона сенсограммы взаимодействия в фазе ассоциации. Описанные подходы к анализу данных высокопроизводительного скрининга могут быть полезны исследователям, работающим с SPR-биосенсорами различных моделей

Особенности пробоподготовки лизатов для повышения эффективности выделения белковых партнеров целевых белков, кодируемых генами 18-ой хромосомы человека

The aim of this work was to test modifications of the standard protocol for the sample preparation of cell/tissue lysate before performing the affinity isolation of lysate protein partners for the target protein (bait protein) which is covalently immobilized on an inert sorbent (e.g. BrCN-, SH-Sepharose 4B) or a carrier (e.g. paramagnetic nanoparticles). The series of our previous works on applying the approach to direct molecular fishing procedure with combination of affinity chromatography and LC-MS/MS analysis using a number of proteins, encoded by the genes of human chromosome 18, have shown that there are at least two problems affecting the specificity and the effectiveness of this procedure. These include: (i) redundancy of the background proteins in the eluates from an affinity sorbent (carrier) due to isolation of multiprotein complexes “labeled” with a direct protein partner which binds with a bait protein immobilized on the sorbent; (ii) low enrichment of the eluates with appropriate protein partners due to the fact that some direct protein partners in the lysate exist in stable “wild type” complexes with the bait protein itself. This means that latter group of protein partners will not be sufficiently isolated from lysate. Therefore, in order to increase the specificity and efficiency of affinity isolation of protein partners for the bait protein, we modified the standard protocol of lysate preparation and the preliminary step on dissociation of lysate protein complexes was added. Several model experiments for the choice of regeneration solution, assessment of their efficiency in the dissociation of lysate protein complexes as well as the stability and binding capacity of proteins were performed under the control of surface plasmon resonance (SPR) biosensor Biacore 3000 using HepG2 cell lysate. It was shown that acid treatment and incubation of the cell lysate for one min on ice (final lysate dilution 20 times) and subsequent neutralization (pH shift from 2.0 to 7.4) resulted in maximal dissociation of the lysate protein complexes without significant negative effects on the protein-protein interactions tested.Целью работы было экспериментальное тестирование модификации стандартного протокола пробоподготовки клеточного/ тканевого лизата перед выполнением процедуры аффинного выделения из него белков-партнеров для целевого белка (белка-наживки), иммобилизованного на инертном сорбенте или парамагнитных наночастицах. Цикл наших предыдущих работ, посвященных прямому молекулярному фишингу с сопряжением хроматографических и масс-спектрометрических методов и технологии парамагнитных наночастиц c использованием ряда белков 18-ой хромосомы человека и также других белков показал, что существуют, по крайне мере, две проблемы, влияющие на специфичность и эффективность данной процедуры: (i) избыточность фоновых белков в элюатах с аффинного сорбента, обусловленная выделением мультибелковых комплексов, меченых прямым партнером, который связывается с целевым белком на сорбенте; (ii) низкая обогащенность элюатов белками-партнерами целевой группы обусловленная тем, что та или иная часть прямых белков-партнеров в лизате находится в составе стабильных комплексов «дикого типа» с самим белком-наживкой и не будет в достаточной степени выделена из лизата. Поэтому для повышения специфичности и эффективности аффинного выделения белков-партнеров целевого белка нами предложена модификация стандартной пробоподготовки, заключающаяся в предварительной диссоциации белковых комплексов лизата. Модельные эксперименты по выбору регенерационного раствора, оценке стабильности и связывающей способности белков при его воздействии, а также оценка эффективности диссоциации комплексов в лизате были выполнены под контролем оптического биосенсора Biacore 3000 («GE Healthcare», США) с использованием лизата клеточной культуры гепатокарциномы человека (HepG2) и рекомбинантных препаратов белков, кодируемых генами 18-ой хромосомы человека, Показано, что кислотная обработка разбавленного в 20 раз лизата с кратковременной экспозицией в течение 1 мин на льду и с последующей нейтрализацией (с рН 2.0 до рН 7.4) приводила к максимальной диссоциации белковых комплексов лизата, не оказывая существенного негативного влияния на тестируемые белок- белковые взаимодействия