Inhibitors of tyrosine kinases and phosphatases as a tool for the investigation of microtubule role in plant cold response

Tyrosine phosphorylation plays a vital role in the variety of signal transduction pathways in eukaryotic cells, however its role and relevance in plants are still largely unknown. To investigate the functional role of tubulin tyrosine phosphorylation in plant cells the interplay between the effects of tyrosine kinases (herbimycin A) as well as tyrosine phosphatases (sodium orthovanadate) inhibitors on microtubules sensitivity to cold in A. thaliana root cells were studied. Since it was found that inhibition of tyrosine kinases significantly increased the microtubules sensitivity to cold, while inhibition of tyrosine phophatases enhanced their cold-resistance, we suggest an existence of certain functional interaction between the phosphorylation on tyrosine residues and sensitivity of cortical microtubules to low temperatures.Фосфорилирование остатков тирозина является важным компонентом сигнальных каскадов в эукариотических клетках, однако его роль и значимость в растениях остается практически неизвестной. Для того чтобы выяснить функциональную роль тирозинфосфорилирования тубулина в растительной клетке, исследовали взаимосвязь между влиянием ингибитора тирозинкиназ (гербимицина А) и тирозинфосфатаз (ортованадата натрия) и чувствительностью микротрубочек в клетках корня A. thaliana к действию холода. Поскольку было выявлено, что ингибирование тирозинкиназ значительно увеличивает чувствительность микротрубочек к холоду, а ингибирование тирозинфосфатаз повышает их холодоустойчивость, мы предполагаем наличие определенной функциональной взаимосвязи между фосфорилированием по остаткам тирозина и чувствительностью кортикальных микротрубочек к действию холода.Фосфорилювання залишків тирозину є важливим компонентом сигнальних каскадів в еукаріотичних клітинах, проте його роль і важливість в рослинах дотепер залишається практично невідомою. Щоб виявити функціональну роль тирозинфосфорилювання тубуліну в рослинній клітині, досліджено взаємозв’язок між впливом інгібіторів тирозинкіназ (гербіміцину А) і тирозинфосфатаз (ортованадату натрію) та чутливістю мікротрубочок в клітинах кореня A. thaliana до дії холоду. Оскільки було встановлено, що інгібування тирозинкіназ значно збільшує чутливість мікротрубочок до холоду, тоді як інгібування тирозинфосфатаз підвищує їхню холодостійкість, ми припускаємо існування певного функціонального взаємозв’язку між фосфорилюванням по залишках тирозину та чутливістю кортикальних мікротрубочок до низьких температур

Effects of tyrosine kinase and phosphatase inhibitors on mitosis progression in synchronized tobacco BY-2 cells

To test whether reversible tubulin phosphorylation plays any role in the process of plant mitosis the effects of inhibitors of tyrosine kinases, herbimycin A, genistein and tyrphostin AG 18, and of an inhibitor of tyrosine phosphatases, sodium orthovanadate, on microtubule organization and mitosis progression in a synchronized BY-2 culture has been investigated. It was found that treatment with inhibitors of tyrosine kinases of BY-2 cells at the G2/M transition did not lead to visible disturbances of mitotic microtubule structures, while it did reduce the frequency of their appearance. We assume that a decreased tyrosine phosphorylation level could alter the microtubule dynamic instability parameters during interphase/prophase transition. All types of tyrosine kinase inhibitors used caused a prophase delay: herbimycin A and genistein for 2 h, and tyrphostin AG18 for 1 h. Thereafter the peak of mitosis was displaced for 1 h by herbimycin A or genistein exposure, but after tyrphostin AG18 treatment the timing of the mitosis-peak was comparable to that in control cells. Enhancement of tyrosine phosphorylation induced by the tyrosine phosphatase inhibitor resulted in the opposite effect on BY-2 mitosis transition. Culture treatment with sodium orthovanadate during 1 h resulted in an accelerated start of the prophase and did not lead to the alteration in time of the mitotic index peak formation, as compared to control cells. We suppose that the reversible tyrosine phosphorylation can be involved in the regulation of interphase to M phase transition possibly through regulation of microtubule dynamics in plant cells.Для изучения участия обратимого фосфорилирования белков в прохождении митоза растительной клеткой исследовано влияние на этот процесс и организацию микротрубочек в синхронизированной культуре BY-2 ингибиторов тирозинкиназ – гербимицина А, генистеина и тирфостина AG18, а также ингибитора тирозинфосфатаз – ортованадата натрия. Обнаружено, что обработка клеток BY-2 ингибиторами тирозинкиназ при прохождении G2/M фазы не приводила к видимым нарушениям митотических структур микротрубочек, однако вызывала уменьшение их количества. Возможно, снижение уровня фосфорилирования белков микротрубочек по остаткам тирозина может нарушать динамические свойства микротрубочек при прохождении интерфазы/профазы. Все использованные ингибиторы тирозинкиназ приводили к задержке вступления клеток в профазу: гербимицин А и генистеин – на 2 ч, тирфостин AG18 – на 1 ч. После обработки гербимицином А или генистеином отмечали задержку в появлении пика митоза на 1 ч по сравнению с контролем, а после обработки тирфостином AG18 изменений не было. Обработка культуры клеток ингибитором тирозинфосфатаз ортованадатом натрия на протяжении 1 ч оказывала противоположное воздействие на прохождение митоза: вступление клеток в профазу ускорялось, но без изменений во времени формирования митотического пика по сравнению с контролем. Можно предположить, что фосфорилирование белков по остаткам тирозина является важным звеном в регуляции перехода клеток из интерфазы в М-фазу посредством регуляции динамических свойств микротрубочек в растительных клетках.Щоб дослідити участь зворотного фосфорилювання білків у проходженні мітозу рослиною клітини, вивчено вплив на цей процес і організацію мікротрубочок в синхронізованій культурі BY-2 інгібіторів тирозинкіназ – гербіміцину А, геністеїну та тирфостину AG18, а також інгібітора тирозинфосфатаз – ортованадату натрію. Виявлено, що обробка клітин BY-2 інгібіторами тирозинкіназ при проходженні G2/M не призводила до очевидних порушень мітотичних структур, проте викликала зменшення їхньої кількості. Можливо, що зниження рівня тирозинфосфорилювання білків мікротрубочок по залишках тирозину може порушувати динамічні властивості мікротрубочок впродовж інтерфази/профази. Всі використані нами інгібітори тирозинкіназ призводили до затримки входження клітин у профазу: гербіміцин А і геністеїн – на 2 год, тирфостин AG18 – на 1 год. Після обробки гербіміцином А або геністеїном виявлено затримку в прояві піку мітозу на 1 год у порівнянні з контролем, а після обробки тирфостином AG18 змін не було. Обробка культури клітин інгібітором тирозинфосфатаз, ортованадатом натрію впродовж 1 год призводила до протилежного впливу на проходження мітозу: вступ клітин в профазу прискорювався, проте без змін в часі формування мітотичного піку в порівнянні із контролем. Можна зробити припущення про те, що зворотне тирозинфосфорилювання білків по залишках тирозину є важливою ланкою в регуляції переходу із інтерфази в М-фазу за рахунок регуляції динамічних властивостей мікротрубочок в рослинних клітинах

Crambe aspera plants in vitro propagation and its effect on fatty acids and phenolic compounds content and genome stability

In vitro culture can be used for endangered species preservation but its effect on biochemical properties and genetic stability of plants requires further research. Aim. The study on fatty acids content, phenolic compounds and phylogenetic relationships of Crambe aspera plants upon aseptic cultivation in vitro. Methods. Morphogenic potential of Crambe aspera leaf, root and petiole explants was studied in the Murashige and Skoog (MS) medium with different concentrations of growth factors. Fatty acids (FA) content was determined by gas chromatography-mass spectrophotometry of FA ethers, phenolic compounds were determined by spectrophotometry. Polymerase chain reactions were used to study phylogenetic relationships. Results. The efficient protocols of seed surface sterilization as well as methods of fast microclonal multiplication and obtention of C. aspera callus tissue for were developed. Conclusions. Leaves of both in vitro and in vivo cultured plants had a high content of α-linolenic acid whereas erucic acid was absent. At the same time, the difference in biochemical composition between the plants grown in aseptic and non-aseptic conditions was shown. In vivo populations of C. aspera showed a high level of polymorphism but its genome did not undergo changes after the in vitro establishment.Застосування культури іn vitro для збереження рідкісних видів має ряд переваг. Мета. Дослідження вмісту жирних кислот, фенольних сполук та філогенетичних зв’язків рослин Crambe aspera може допомогти оцінити вплив культивування in vitro. Методи. Було досліджено морфогенний потенціал листкових, кореневих та черешкових експлантів Crambe aspera на середовищі MS з різним вмістом регуляторів росту. Вміст жирних кислот визначали за допомогою газової хромато-мас спектрометрії ефірів жирних кислот. Вміст фенольних сполук визначали за допомогою спектрофотометра. Полімеразна ланцюгова реакція була застосована для дослідження філогенетичних зв’язків. Результати. Було встановлено ефективні протоколи поверхневої стерилізації насіння разом з методами швидкого мікроклонального розмноження та отримання калюсної культури для виду C. aspera. Висновки. Отримані результати свідчать про високий вміст α-ліноленової та відсутність еруковї кислоти у листках рослин що культивували як in vitro, так і in vivo. В той же час, було встановлено різницю біохімічного складу між рослинами з асептичних та грунтових умов. Популяції C. aspera що зростали в умовах in vivo показали високий рівень поліморфізму але їх геном після введення культуру in vitro був стабільнимИспользование культуры іn vitro с целью сохранения редких видов имеет ряд преимуществ. Цель. Исследование состава жирных кислот, фенольных соединений и филогенетических связей растений Crambe aspera может помочь в оценке влияния культивирования in vitro. Методы. Было установлено морфогенный потенциал листовых, корешковых и черешковых эксплантов Crambe aspera на среде MS с различным составом регуляторов роста. Содержание жирных кислот определяли с помощью газовой хромато-масс спектрометрии эфиров жирных кислот. Содержание фенольных соединений определяли на спектрофотомере. Полимеразная цепная реакция была использована для исследования филогенетических связей. Результаты. Было установлено эффективные протоколы поверхностной стерилизации семян вместе с методами быстрого микроклонального размножения и получения калюсной культуры для вида C.°aspera. Выводы. Полученные результаты свидетельствуют о высоком содержании α-линоленовой и отсутствии эруковой кислоты в листьях растений культивируемых как in vitro, так и in vivo. В то же время была установлена разница биохимического состава между растениями из асептических и грунтовых условий. Популяции C. aspera произрастающие в условиях in vivo показали высокий уровень полиморфизма, но их геном после введения в культуру in vitro был стабильным

Effects of tyrosine kinase and phosphatase inhibitors on mitosis progression in synchronized tobacco BY-2 cells

To test whether reversible tubulin phosphorylation plays any role in the process of plant mitosis the effects of inhibitors of tyrosine kinases, herbimycin A, genistein and tyrphostin AG 18, and of an inhibitor of tyrosine phosphatases, sodium orthovanadate, on microtubule organization and mitosis progression in a synchronized BY-2 culture has been investigated. It was found that treatment with inhibitors of tyrosine kinases of BY-2 cells at the G2/M transition did not lead to visible disturbances of mitotic microtubule structures, while it did reduce the frequency of their appearance. We assume that a decreased tyrosine phosphorylation level could alter the microtubule dynamic instability parameters during interphase/prophase transition. All types of tyrosine kinase inhibitors used caused a prophase delay: herbimycin A and genistein for 2 h, and tyrphostin AG18 for 1 h. Thereafter the peak of mitosis was displaced for 1 h by herbimycin A or genistein exposure, but after tyrphostin AG18 treatment the timing of the mitosis-peak was comparable to that in control cells. Enhancement of tyrosine phosphorylation induced by the tyrosine phosphatase inhibitor resulted in the opposite effect on BY-2 mitosis transition. Culture treatment with sodium orthovanadate during 1 h resulted in an accelerated start of the prophase and did not lead to the alteration in time of the mitotic index peak formation, as compared to control cells. We suppose that the reversible tyrosine phosphorylation can be involved in the regulation of interphase to M phase transition possibly through regulation of microtubule dynamics in plant cells.Для изучения участия обратимого фосфорилирования белков в прохождении митоза растительной клеткой исследовано влияние на этот процесс и организацию микротрубочек в синхронизированной культуре BY-2 ингибиторов тирозинкиназ – гербимицина А, генистеина и тирфостина AG18, а также ингибитора тирозинфосфатаз – ортованадата натрия. Обнаружено, что обработка клеток BY-2 ингибиторами тирозинкиназ при прохождении G2/M фазы не приводила к видимым нарушениям митотических структур микротрубочек, однако вызывала уменьшение их количества. Возможно, снижение уровня фосфорилирования белков микротрубочек по остаткам тирозина может нарушать динамические свойства микротрубочек при прохождении интерфазы/профазы. Все использованные ингибиторы тирозинкиназ приводили к задержке вступления клеток в профазу: гербимицин А и генистеин – на 2 ч, тирфостин AG18 – на 1 ч. После обработки гербимицином А или генистеином отмечали задержку в появлении пика митоза на 1 ч по сравнению с контролем, а после обработки тирфостином AG18 изменений не было. Обработка культуры клеток ингибитором тирозинфосфатаз ортованадатом натрия на протяжении 1 ч оказывала противоположное воздействие на прохождение митоза: вступление клеток в профазу ускорялось, но без изменений во времени формирования митотического пика по сравнению с контролем. Можно предположить, что фосфорилирование белков по остаткам тирозина является важным звеном в регуляции перехода клеток из интерфазы в М-фазу посредством регуляции динамических свойств микротрубочек в растительных клетках.Щоб дослідити участь зворотного фосфорилювання білків у проходженні мітозу рослиною клітини, вивчено вплив на цей процес і організацію мікротрубочок в синхронізованій культурі BY-2 інгібіторів тирозинкіназ – гербіміцину А, геністеїну та тирфостину AG18, а також інгібітора тирозинфосфатаз – ортованадату натрію. Виявлено, що обробка клітин BY-2 інгібіторами тирозинкіназ при проходженні G2/M не призводила до очевидних порушень мітотичних структур, проте викликала зменшення їхньої кількості. Можливо, що зниження рівня тирозинфосфорилювання білків мікротрубочок по залишках тирозину може порушувати динамічні властивості мікротрубочок впродовж інтерфази/профази. Всі використані нами інгібітори тирозинкіназ призводили до затримки входження клітин у профазу: гербіміцин А і геністеїн – на 2 год, тирфостин AG18 – на 1 год. Після обробки гербіміцином А або геністеїном виявлено затримку в прояві піку мітозу на 1 год у порівнянні з контролем, а після обробки тирфостином AG18 змін не було. Обробка культури клітин інгібітором тирозинфосфатаз, ортованадатом натрію впродовж 1 год призводила до протилежного впливу на проходження мітозу: вступ клітин в профазу прискорювався, проте без змін в часі формування мітотичного піку в порівнянні із контролем. Можна зробити припущення про те, що зворотне тирозинфосфорилювання білків по залишках тирозину є важливою ланкою в регуляції переходу із інтерфази в М-фазу за рахунок регуляції динамічних властивостей мікротрубочок в рослинних клітинах