Structure et fonction des hélicases de la famille RecQ (rôle du doigt de zinc dans la régulation des activités enzymatiques)

La famille RecQ des ADN hélicases est impliquée dans la maintenance de la stabilité génomique. Nous nous sommes intéressés, au cours de ce travail, au rôle du doigt de zinc du domaine RecQ Ct de ces hélicases. Les résultats indiquent que le motif à doigt de zinc est impliqué dans la fixation à l'ADN et le repliement correct de la protéine RecQ. Nous avons montré que le domaine hélicase de RECQ5 possède une activité intrinsèque qui tend à favoriser l'hybridation d'ADN et que le doigt de zinc de RECQ5(3 régule la fixation à l'ADN, l'activité ATPase, le déroulement de l'ADN, l'hybridation de l'ADN et l'échange des brins d'ADN. II semble que la présence du doigt de zinc est essentielle pour les activités ATPase et hélicase des hélicases RecQ, mais pas pour l'activité d'hybridation d'ADN. Notre travail sur les hélicase RecQ de Bacillus subtilis soutient aussi cette conclusionThe RecQ family of the DNA helicases is involved in the maintenance of genomic stability. During this work, we analyzed the function of the zinc finger of the RecQ Ct domain of the RecQ family helicases. We showed that the zinc finger is involved in DNA binding and in the correct folding of the RecQ protein. It has been shown for the first time that the RECQ5 helicase domain has an intrinsically high ssDNA annealing activity and the zinc finger motif regulates the DNA binding, ATPase, unwinding, strand annealing and strand exchange activities of the helicase domain. The presence of the zinc finger is essential for the ATPase and helicase activity, but not for the DNA annealing activity. Our works on the RecQ helicases from Bacillus subtilis also support this conclusionCACHAN-ENS (940162301) / SudocSudocFranceF

The molecular aspects of RecQ helicase family

Dans les cellules, le déroulement de l ADN double-brin est catalysé par une famille de protéines appelées hélicases. Ces protéines sont présentes chez tous les organismes des virus jusqu à l'homme. Parmi ces hélicases, celles de la famille RecQ jouent un rôle essentiel dans le métabolisme de l ADN en facilitant de nombreux processus cellulaires tels que la réplication, la réparation, la recombinaison, la transcription et la maintenance des télomères. Chez l'homme, il existe cinq membres de la famille RecQ identifiés comme RECQ1, BLM, WRN, RECQ4 et RECQ5. Les mutations dans BLM, WRN et RECQ4 sont associées à une prédisposition au cancer. En plus du domaine hélicase très conservé et contenant sept motifs bien distincts, la plupart des hélicases de la famille RecQ possèdent également un domaine RecQ C-terminal (RecQ-Ct) et un domaine hélicase RNase D (HRDC). Au cours de ce travail, nous nous concentrons sur les mécanismes intrafonctionnels de certains membres de la famille RecQ des hélicases. Tout d'abord, nous avons utilisé deux isoformes naturels de l hélicase RECQ5 humain comme modèle pour étudier la modulation fonctionnelle du domaine hélicase avec le doigt de zinc. Ici, nous montrons que la variante tronquée RECQ5a de l hélicase RECQ5b issue d un épissage alternatif et composée uniquement du domaine hélicase ne possède ni l activité ATPase ni l activité de déroulement de l ADN. A l inverse, et ce de matière étonnante, cette protéine est dotée d une forte activité de réhybridation du brin déroulé. Les mesures quantitatives indiquent que l amélioration de l affinité de la protéine pour l ADN que lui confère le doigt de zinc est à l origine de ses activités ATPase et hélicase. Le plus important est que l on constate que le doigt de zinc est capable d'agir comme un facteur moléculaire à même de supprimer l'activité de re-synthèse du brin déroulé par le domaine hélicase et de déclencher l activité de déroulement d'ADN à travers une modulation de la fixation à l ADN. Ensuite, nous avons analysé les propriétés biochimiques de deux isoformes de l hélicase RecQ de Bacillus subtilis : SubL et SubS. Parmi elles, SubS ne dispose pas du domaine HRDC. Nos études montrent que le domaine HRDC est crucial pour Bacillus subtilis RecQ hélicases dans la résolution des intermédiaires de réplication et / ou de réparation de l'ADN tels que les jonctions de Holliday et la jonction de kappa. Les activités ATPase, hélicase et l'activité de rehybridation du brin déroulé sont plus importantes en présence du domaine HRDC. Ces résultats nous permettent de spéculer sur l'importance du domaine HRDC des activités de la famille de RecQ hélicase. Nous avons découvert que dans la famille RecQ, le 12 domaine HRDC peut augmenter les activités ATPases et hélicases. De manière intéressante, le domaine HRDC de Bacillus subtilis joue un rôle critique dans la résolution des intermédiaires de réplication ou de réparation de l'ADN et des jonctions de Holliday. Nous suggérons l'hypothèse que le domaine HRDC des hélicases RecQ participe à exposer leurs fonctions dans le processus de réparation de l'ADN. Dans la dernière partie, nous nous sommes intéressés à l'existence et au rôle du doigt d'arginine dans la protéine BLM. Ces études ont été menées afin de démontrer son rôle dans l'hydrolyse d'ATP et dans la conversion en mouvement mécanique permettant à la protéine de progresser le long de l ADN. Nos études démontrent que le résidu R982, situé à proximité du g-phosphate de l'ATP, fonctionne comme un doigt d arginine dans la protéine BLM. Nos conclusions indiquent en outre que ce doigt d arginine interagit avec d'autres motifs conservés situés autour du g-phosphate des nucléotides et qu ils effectuent ensemble les fonctions enzymatiques au sein d un réseau complexe.In the cells, the unwinding of double-stranded polynucleotides is catalyzed by helicases that exist in all kingdoms of life from virus to human. RecQ family helicases play essential roles in nucleic acid metabolism by facilitating cellular processes including genome replication, DNA repair, recombination, transcription and telomere maintenance. In human, five RecQ family members named RECQ1, BLM, WRN, RECQ4 and RECQ5, have been identified. Defects in BLM, WRN and RECQ4 will give rise to autosomal recessive disorders and predisposition to cancer. In addition to the highly conserved helicase core domain containing seven helicase motifs, most RecQ family helicases have a unique RecQ C-terminal domain (RecQ-Ct) and the Helicase RNase D conserved domain (HRDC). In the present studies, we focus on the intra-functional mechanisms of some important members of RecQ family helicases. Firstly, we have chosen two natural isoforms of human RECQ5 helicase as models to study the functional modulation of the helicase core domain by the zinc-binding domain. Here we show that a truncated variant of the human RECQ5b helicase comprised of the conserved helicase domain only, a splice variant named RECQ5a, possesses neither ATPase nor DNA unwinding activities, but surprisingly displays a strong strand annealing activity. Quantitative measurements indicate that the regulatory role of the zinc-binding motif of RECQ5b is achieved by enhancing the DNA binding affinity of the helicase. More important, the zinc-binding motif of RECQ5b is found to act as a molecular switch that suppresses the strand-annealing activity of the helicase domain and triggers DNAunwinding activity of the enzyme through enhancing DNA binding. Subsequently, we analyzed the biochemical properties of two isoforms of Bacillus subtilis RecQ helicases: SubL and SubS. Between them, SubS naturally lacks the HRDC domain. Our studies demonstrate that the HRDC domain is crucial in Bacillus subtilis RecQ helicases in unwinding of DNA replication/repair intermediates such as Holliday junction and kappa junction. The enzyme with HRDC domain shows stronger ATPase activity and DNA unwinding and annealing activities than the other one. These results allow us to speculate on the importance of HRDC domain in the basic activities of RecQ family helicases. In the last part, we investigated the existence and role of the arginine finger in the Bloom syndrome protein (BLM) in ATP hydrolysis and energy coupling. Our studies demonstrate that R982 is the residue located near the g-phosphate of ATP which functions as a BLM 14 arginine finger. Our finding further indicates that the arginine finger interacts with other conserved motifs around g-phosphate of the nucleotide to carry out the functions as a complex network.CACHAN-ENS (940162301) / SudocSudocFranceF

Biochemical and structural characterization of BLM Helicase

Les Hélicases sont un sous-ensemble d'enzymes qui couplent l'énergie provenant de l'hydrolyse des nucléosides triphosphates (NTP) à la séparation des duplex d'acides nucléiques. Elles sont essentielles au métabolisme de l'ADN et de l'ARN (réparation, réplication, recombinaison et transcription). Les hélicases de la famille de RecQ sont essentielles et ont été très conservées lors de l'évolution. Chez l'humain, trois hélicases de type RecQ sont liées à de graves désordres autosomiques. Ils s'agissent du syndrome de Bloom (BS), du syndrome de Werner (WS) et du syndrome de Rothmund-Thomson (RTS) liés respectivement aux hélicases BLM, WRN et RecQ4. Cette thèse se focalise sur l'analyse des relations structurales et fonctionnelles de BLM. La formation d'érythèmes après exposition au soleil et le retard de croissance sont les principaux phénotypes du BS. La stérilité (ou l'infertilité), l'immunodéficience, et la prédisposition à un large spectre de cancers sont également les symptômes cliniques des patients BS. Les brèches et cassures de chromatides, les réarrangements structuraux de chromosomes, la configuration quadriradiale symétrique, tout comme les associations télomériques ou la quantité excessive de ponts d'anaphase représentent autant d'autres caractéristiques des patients BS. Mais, la haute fréquence d'échanges entre chromatides sœurs (SCE) détectable sous le microscope dans les lymphocytes du sang reste à l'heure actuelle le moyen le plus efficace de diagnostiquer la maladie. Cette thèse présente des résultats nouveaux, publiés dans trois articles scientifiques dan des journaux internationau x, sur les relations entre structure et fonctions de l'hélicase BLM qui peuvent être utiles dans l'identification de nouvelles stratégies thérapeutiques du syndrome de BLOOM.Bloom's syndrome (BS) is an autosomal recessive disorder, showing high frequency of sister chromatid exchange in lymphocyte of the patients. Since BS is preposition of a wide spectrum of cancer, the syndrome has been studied for understanding of the mechanism of cancer extensively. ln the first part, we proved the existence of a zinc-binding domain in which a zinc ion is coordinated by four cysteines residues in RecQ-Ct domain of BLM. This conclusion is drawn from our biophysical and biochemical studies. We modeled the 3D structure of BLM protein based on that of E.coli RecQ helicase, which revealed a similar structural domain in both helicases that coordinate zinc. The results from experiments with three mutants showed that their enzymatic activities were severely reduced or abrogated. The demetalization of zinc from BLM had no influence on the activities of BLM, but it would decrease the themostability of the protein. ln conclusion, BLM contains a zinc binding domain with one zinc ion in each protein. The second part of our studies includes the work for understanding of causative molecular mechanism of missense mutations which happened in helicase domain of BLM found in BS patients. On the basis of the work inthe fist part, we further modeled the 3D structure of BLM in complex with A TPyS and DNA. With the model, we deduced the possible causative mechanism of mutants. We produced mutant proteins and purified them to homogeneity. The A TPase activity, A TP binding activity, DNA binding activity and helicase activity ofthe mutants were ail checked. ln conclusion 1 showed that: 1. BLM642-129o possibly employ an "inchworm" model mechanism; 2. Amino acid residues from 861 to 901 are imprtant for DNA binding; 3. DNA binding ofBLM is mainly controlled by lobe2 and lobe3, lobel contribute to a transient ssDNA binding; 4.The annealing activity of RecQ helicase suggests a weak DNA binding activity.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Human replication protein A induces dynamic changes in single-stranded DNA and RNA structures

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Study on Formation Mechanism of Zonal Disintegration of Surrounding Rock in Deep Tunnel

With the construction of underground rock engineering, the surrounding rock in deep tunnels appears zonal disintegration of fracture and intact zones alternate distribution, which is a special engineering geological phenomenon. This study establishes a partitioned fracture model under the coupling of high in-situ stress and osmotic pressure, and identify the key influencing factors of the fracture model. Furthermore, a stress intensity factor (SIF) of initial cracks on surrounding rock elastoplastic boundary is derived using the transformation of complex functions. Considering the high seepage pressure of the surrounding rocks, a zonal fracture initiation criterion is established combined with the analysis of redistributed stress fields. Finally, the obtained criterion is embedded into an extended finite element method (XFEM) platform for numerical simulation. Taking the maximum circumferential tensile stress as a cracking criterion, the propagation trajectory of rock cracks is traced by contour methods. Calculation results have realized the modelling of a whole process of crack initiation, propagation, and formation. And the established criterion has be verified

Finite Element Analysis on Lining Structure of Diversion Tunnel in a Hydropower Station

Aiming at the high internal and external water pressure tunnels built in unfavorable geological bodies, this study proposes a novel type of composite support structure in which steel plates are poured inside concrete linings. Compared with traditional structures, it has the advantages of higher tensile strength, better crack resistance, and impermeability. Taking the diversion tunnel of a hydropower station as an example, based on linear and non-linear finite element simulations, mechanical properties of the steelconcrete composite lining structure for a hydraulic tunnel in soft surrounding rocks are analyzed. On this basis, the concrete crack control under this supporting condition is verified. Research results can provide a reference for the selection of reasonable steel plate thicknesses and reinforcement types in design

Hypertonic saline for prevention of delirium in geriatric patients who underwent hip surgery

Abstract Background Postoperative delirium (POD) is a common disorder in the elderly patients, and neuroinflammation is the possible underlying mechanism. This study is designed to determine whether or not hypertonic saline (HS) pre-injection can alleviate POD in aged patients. Methods This prospective study recruited 120 geriatric patients who underwent hip surgery. The patients were randomly divided into two groups: control group (NS group) and HS group. Patients in the NS group were pre-injected with 4 mL/kg isotonic saline, and those in the HS group were pre-injected with 4 mL/kg 7.5% HS. All 120 patients were then subjected to general anesthesia. Blood samples were extracted to detect the concentration of inflammatory factors, namely, IL-1β, IL-6, IL-10, and TNF-α, and the nerve injury factor S100β. Flow cytometry was used to detect the number of monocytes in peripheral venous blood and evaluate the relationship of inflammation to delirium. The nursing delirium screening scale (Nu-DESC) was used to determine cognitive function 1 to 3 days postoperatively. Results Analysis using random-effect multivariable logistic regression indicated that HS administration before anesthesia was associated with a low risk of POD (odds ratio [OR], 0.13; 95% CI, 0.04 to 0.41; P = 0.001) and few CD14 + CD16+ monocytes (β = − 0.61; 95% CI, − 0.74 to − 0.48; P = 0.000) the following day. When the association between HS and delirium was controlled for CD14 + CD16+ monocytes, the effect size became nonsignificant (odds ratio [OR], 0.86; 95% CI, 0.14 to 5.33; P = 0.874). TNF-α was significantly associated with POD (odds ratio [OR], 1.10; 95% CI, 1.05 to 1.16; P = 0.000). However, IL-1β, IL-6, IL-10, and S100β were not significantly related to POD. Conclusion HS can alleviate POD in geriatric patients and may inhibit the secretion of inflammatory factors by monocytes

RQC helical hairpin in Bloom's syndrome helicase regulates DNA unwinding by dynamically intercepting nascent nucleotides.

The RecQ family of helicases are important for maintenance of genomic integrity. Although functions of constructive subdomains of this family of helicases have been extensively studied, the helical hairpin (HH) in the RecQ-C-terminal domain (RQC) has been underappreciated and remains poorly understood. Here by using single-molecule fluorescence resonance energy transfer, we found that HH in the human BLM transiently intercepts different numbers of nucleotides when it is unwinding a double-stranded DNA. Single-site mutations in HH that disrupt hydrogen bonds and/or salt bridges between DNA and HH change the DNA binding conformations and the unwinding features significantly. Our results, together with recent clinical tests that correlate single-site mutations in HH of human BLM with the phenotype of cancer-predisposing syndrome or Bloom's syndrome, implicate pivotal roles of HH in BLM's DNA unwinding activity. Similar mechanisms might also apply to other RecQ family helicases, calling for more attention to the RQC helical hairpin