Avaliação do potencial citotóxico das lectinas leguminosas Dioclea reflexa I E Canavalia brasiliensis em culturas celulares das linhagens C6 (Rattus norvegicus) e U87 (Homo sapiens)

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2017.Os gliomas representam 50-80 % dos tumores cerebrais primários classificados como um dos tipos de neoplasia com maiores desafios na sua terapia. Dentre eles o glioblastoma multiforme (GBM) é o tipo mais agressivo, com um prognóstico pouco favorável, sendo a sobrevida média dos pacientes de aproximadamente 12 meses. Considerando a limitada eficiência das terapias disponíveis, têm sido investigadas novas moléculas bioativas. Lectinas são proteínas que ligam glicanos, apresentando diversas atividades biológicas. Estudos recentes têm indicado a capacidade de algumas lectinas isoladas de plantas, especialmente ConA, poderem induzir morte de células tumorais com certa seletividade, considerando que essas células podem apresentar alterações no padrão de glicosilação. Dentro desses paradigmas, o presente trabalho teve como objetivo central investigar o efeito citotóxico das lectinas purificadas das sementes de Dioclea reflexa (DrfL I) e de Canavalia brasiliensis (ConBr) sobre culturas celulares de glioma das linhagens C6 (rato) e U87 (humana), caracterizando o possível mecanismo dessa ação. Os resultados demonstraram que as lectinas DrfL I e ConBr (30 e 50 ?g/mL) diminuem a viabilidade (avaliada pelo ensaio de MTT) e induzem alterações morfológicas (avaliada por microscopia de luz e de fluorescência) sobre células da linhagem C6. As lectinas também demonstraram a capacidade de inibir a migração celular e sobrevivência clonogênica, especialmente na concentração mais elevada (50 ?g/mL). Além disso, ConBr e DrfL I causaram indução significativa do processo de autofagia na linhagem C6, avaliado através da coloração com laranja de acridina (LA). Notavelmente, a ação das lectinas foi dependente da integridade de sua estrutura terciária/quaternária, bem como do domínio de interação com carboidratos (CRD), considerando que a desnaturação térmica e o bloqueio do CRD (com ?-metil-manosídeo), respectivamente, levaram a perda da atividade das lectinas. Quando avaliada a ação de DrfL I e ConBr sobre a linhagem U87 (humana) foi observado que apenas DrfL I apresentou atividade citotóxica sobre esta linhagem, sendo sua ação similar ao observado sobre as células da linhagem C6. Dessa forma, nosso estudo sugere um potencial antitumoral para a lectina DrfL I, considerando sua ação sobre a linhagem de glioma U87, que deverá ser avaliada com mais profundidade em futuros estudos.Abstract : Gliomas represent 50-80 % of the primary brain tumors and it is one of the most challenging types of neoplasia for therapy. Glioblastoma multiform (GBM) is the most aggressive type of glioma, with unfavorable prognosis and average survival of patients approximately 12 months. Taken in account a limited therapy available, new bioactive molecules have been investigated. Lectins are proteins that bind glycans on cell surface displaying a diversity of biological activities. The capability of plant lectins to induce selective tumoral cell death has been reported, since the tumoral cells may express modifications in the glycosilation pattern. Taken these paradigms, the present work aimed to investigate the citotoxicity of the lectins purified from Dioclea reflexa (DrfL I) and Canavalia brasiliensis (ConBr) seeds against gliomas lineages C6 (rat) and U87 (human), characterizing a possible mechanism for this action. The results showed that DrfL I and ConBr lectins (30 and 50 ?g/mL) decreased cell viability (measured by MTT assay) and induced morphological changes (assessed by optic and fluorescence microscopy) on C6 cells. The lectins also induced inhibition of cell migration and clonogenic survival, especially at highest concentration of 50 ?g/mL. Moreover, both ConBr and DrfL I were able to induce autophagy of C6 cells, as evaluated by acridin orange stain. Noteworthy, the lectin actions were dependent of terceary/quaternary structure and carbohydrate recognition domain (CRD) since both, thermal denaturation as well as CRD blockage (by ?-methyl-manoside), respectively, impaired the lectin activity. The action of DrfL I and ConBr on the U87 lineage (human) was also evaluated. However, only DrfL I demonstrated activity against this lineage, which was very similar that observed against C6 cells lineage. In conclusion, our study suggests an antitumor potential for DrfL I lectin, considering its activity against U87 gliomas lineage. Moreover, future studies will be necessary in order to ascertain the DrfL I mechanisms using in vitro and in vivo models of gliomas

Ação antitumoral das lectinas DrfL I e ConBr via ativação de caspases e autofagia: potencial aplicação em estudos e terapia de gliomas

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2021.O glioblastoma multiforme (GBM) é o tipo de glioma mais agressivo. As células de GBM caracterizam-se por apresentarem habilidade de autorenovação e características de células indiferenciadas, conjuntamente com habilidades de ativação de mecanismos de resistência a temozolomida (TMZ ? quimioterápico de escolha frente ao GBM) e a radioterapia. O padrão de glicosilação atípico das células tumorais promove ativação de vias de sinalização envolvidas na migração, invasão e proliferação celular. Essas características do tumor, associada à limitada eficiência dos quimioterápicos disponíveis e seus efeitos colateriais, fazem que o prognóstico clínico do GBM seja desfavorável. As lectinas são proteínas que reconhecem e ligam-se reversivelmente a glicanos específicos da superfície celular apresentando inúmeros efeitos biológicos. Nos últimos anos houve um aumento nos estudos de lectinas obtidas de plantas, com destaque nas propriedades antitumorais. O objetivo desse trabalho foi demonstrar a capacidade antitumoral das lectinas isoladas de sementes de leguminosas Dioclea reflexa (DrfL I) e Canavalia brasiliensis (ConBr) sobre culturas celulares de glioma. Nossos resultados demostraram que ambas lectinas induziram alterações morfológicas e efeitos citotóxicos sobre culturas de células de glioma das linhagens C6, U-87 MG e GBM1. A ação das lectinas foi dependente da interação com glicanos, sendo o efeito citotóxico aparentemente seletivo para as células tumorais, não alterando a viabilidade e morfologia de astrócitos mantidos em cultura primária. DrfL I e ConBr causaram inibição da migração, adesão, proliferação e sobrevivência das células tumorais, sendo estes efeitos acompanhados da ativação das MAPKs (p38 e JNK (p46/54)), juntamente com inibição de Akt, mTORC1 e a MAPK (ERK1/2). O processo de autofagia foi ativado nas células de GBM, destacado pelo aumento do número de organelas vesiculares ácidas e clivagem da LC3 (Cadeia leve 3 da Proteína 1 associada a Microtúbulos, um marcador de carga do autofagossomo). O inibidor autofágico, 3-methyl-adenine (3-MA), inibiu parcialmente o efeito citotóxico das lectinas. Notavelmente, os inibidores de caspase-8 (IETF-fmk) e JNK (SP600125) conseguiram atenuar a morte celular nas células de GBM tratadas com as lectinas. O tratamento combinado das lectinas com TMZ não promoveu incremento da ação antitumoral quando comparado aos tratamentos individuais. Da mesma forma não acarretaram efeitos aditivos ou sinérgicos sobre a sinalização de MAPKs e Akt. Em síntese, os nossos resultados indicam que as lectinas requerem um domínio de ligação à carboidratos para exercer sua ação antiglioma; a citotoxicidade destas proteínas parece estar associada à ativação do processo de autofagia e ser dependente da ativação de caspase-8. Além disso, pode envolver de forma complexa a modulação das vias de MAPKs e Akt/mTORC1.Abstract: Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive type of glioma. GBM cells are characterized by their ability to self-renew and have features of undifferentiated cells, together with the ability to activate mechanisms of resistance to temozolomide (TMZ ? the standard chemotherapy agent used as treatment of GBM) and radiotherapy. The atypical glycosylation pattern of tumor cells promotes activation of signaling pathways involved in cell migration, invasion and proliferation. These tumor characteristics, associated with the limited efficiency of available chemotherapies and their side effects, make the clinical prognosis of GBM unfavorable. Lectins are proteins that recognize and bind reversibly to specific glycans on the cell surface, presenting numerous biological effects. In recent years there has been an increase in the studies of lectins obtained from plants, with emphasis on antitumor properties. The objective of this work was to demonstrate the antitumor capacity of lectins isolated from the seeds of the legumes Dioclea reflexa (DrfL I) and Canavalia brasiliensis (ConBr) on glioma cell cultures. Our results demonstrated that both lectins induced morphological changes and cytotoxic effects on glioma cell cultures of C6, U-87 MG and GBM1 cell lines. The action of the lectins was dependent on the interaction with glycans, and the cytotoxic effect was apparently selective for tumor cells, not altering the viability and morphology of astrocytes maintained in primary culture. DrfL I and ConBr caused inhibition of tumor cell migration, adhesion, proliferation and survival, and these effects were accompanied by activation of MAPKs (p38 and JNK (p46/54)), along with inhibition of Akt, mTORC1 and the MAPK (ERK1/2). The autophagy process was activated in GBM cells, highlighted by increased numbers of acidic vesicular organelles and cleavage of LC3 (Light chain 3 of Microtubule-associated Protein 1, a marker of autophagosome). The autophagic inhibitor, 3-methyl-adenine (3-MA), partially inhibited the cytotoxic effect of lectins. Notably, the caspase-8 (IETF-fmk) and JNK (SP600125) inhibitors were able to attenuate cell death in GBM cells treated with the lectins. The combined treatment of lectins with TMZ did not promote increased antitumor action when compared to individual treatments. Moreover, they did not entail additive or synergistic effects on MAPKs and Akt signaling. In summary, our results indicate that lectins require a carbohydrate-binding domain to exert their antiglioma action; the cytotoxicity of these proteins seems to be associated with the activation of the autophagy process and to be dependent on the activation of caspase-8. In addition, it may involve in a complex way the modulation of MAPKs and Akt/mTORC1 pathways

Structural prediction and characterization of Canavalia grandiflora (ConGF) lectin complexed with MMP1 : unveiling the antiglioma potential of legume lectins

A glioblastoma (GBM) is a highly malignant primary brain tumor with a poor prognosis because of its invasiveness and high resistance to current therapies. In GBMs, abnormal glycosylation patterns are associated with malignancy, which allows for the use of lectins as tools for recognition and therapy. More specifically, lectins can interact with glycan structures found on the malignant cell surface. In this context, the present work aimed to investigate the antiglioma potential of ConGF, a lectin purified from Canavalia grandiflora seeds, against C6 cells. The treatment of C6 cells with ConGF impaired the mitochondrial transmembrane potential, reduced cell viability, and induced morphological changes. ConGF also induced massive autophagy, as evaluated by acridine orange (AO) staining and LC3AB-II expression, but without prominent propidium iodide (PI) labeling. The mechanism of action appears to involve the carbohydrate-binding capacity of ConGF, and in silico studies suggested that the lectin can interact with the glycan structures of matrix metalloproteinase 1 (MMP1), a prominent protein found in malignant cells, likely explaining the observed effects

Structural analysis of Dioclea lasiocatpa lectin : a C6 cells apoptosis-inducing protein

Lectins are multidomain proteins that specifically recognize various carbohydrates. The structural characterization of these molecules is crucial in understanding their function and activity in systems and organisms. Most cancer cells exhibit changes in glycosylation patterns, and lectins may be able to recognize these changes. In this work, Dioclea lasiocarpa seed lectin (DLL) was structurally characterized. The lectin presented a high degree of similarity with other lectins isolated from legumes, presenting a jelly roll motif and a metal-binding site stabilizing the carbohydrate-recognition domain. DLL demonstrated differential interactions with carbohydrates, depending on type of glycosidic linkage present in ligands. As observed by the reduction of cell viability in C6 cells, DLL showed strong antiglioma activity by mechanisms involving activation of caspase 3