Parallel use of shake flask and microtiter plate online measuring devices (RAMOS and BioLector) reduces the number of experiments in laboratory-scale stirred tank bioreactors

Background Conventional experiments in small scale are often performed in a Black Box fashion, analyzing only the product concentration in the final sample. Online monitoring of relevant process characteristics and parameters such as substrate limitation, product inhibition and oxygen supply is lacking. Therefore, fully equipped laboratory-scale stirred tank bioreactors are hitherto required for detailed studies of new microbial systems. However, they are too spacious, laborious and expensive to be operated in larger number in parallel. Thus, the aim of this study is to present a new experimental approach to obtain dense quantitative process information by parallel use of two small-scale culture systems with online monitoring capabilities: Respiration Activity MOnitoring System (RAMOS) and the BioLector device. Results The same mastermix (medium plus microorganisms) was distributed to the different small-scale culture systems: 1) RAMOS device; 2) 48-well microtiter plate for BioLector device; and 3) separate shake flasks or microtiter plates for offline sampling. By adjusting the same maximum oxygen transfer capacity (OTRmax), the results from the RAMOS and BioLector online monitoring systems supplemented each other very well for all studied microbial systems (E. coli, G. oxydans, K. lactis) and culture conditions (oxygen limitation, diauxic growth, auto-induction, buffer effects). Conclusions The parallel use of RAMOS and BioLector devices is a suitable and fast approach to gain comprehensive quantitative data about growth and production behavior of the evaluated microorganisms. These acquired data largely reduce the necessary number of experiments in laboratory-scale stirred tank bioreactors for basic process development. Thus, much more quantitative information is obtained in parallel in shorter time.Cluster of Excellence “Tailor-Made Fuels from Biomass”, which is funded by the Excellence Initiative by the German federal and state governments to promote science and research at German universities

Experimental design for fermentation media development : statistical design or global random search?

The diversity of combinatorial interactions of medium components with the metabolism of cells as wed as the large number of medium constituents necessary for cellular growth and production do not permit satisfactory detailed modelling. For this reason, experimental search procedures in simultaneous shaking flask experiments are used to optimise fermentation media. As an alternative to the methods of statistical experimental design employed in this field for many decades, the use of stochastic search procedures has been evaluated recently, since these require neither the unimodality of the response surface nor limitations in the number of medium components under consideration. Genetic algorithms were selected due to their basic capability for efficient exploration of large variable spaces. Using a genetic algorithm, it has been experimentally verified, with the aid of process examples, that process improvements can be achieved both for microbial and enzymatic conversions and for cell cultures despite the large number of medium components under simultaneous consideration (about 10 or more). In exploring a new variable space, process improvements of more than 100% were generally achieved. For initial reaction conditions previously 'optimised' via standard procedures it has been possible in most cases to achieve a further improvement of 20-40% of the target quantity. Although the genetic algorithm can be very efficient for exploration of large variable spaces, it is improbable that a 'global optimum' can be precisely identified because of the relatively small number of shaking flask experiments usually performed. As a consequence, a combination of highly directed random searches to explore the n-dimensional variable space with the genetic algorithm and subsequent application of classical statistical experimental design is recommended for media development

Ethanolproduktion mit immobilisiertem Zymomonas mobilis im Wirbelschichtreaktor

Um den wirtschaftlichen Herausforderungen der technischen Ethanolgärung - hohe Kapitalkosten und hoher Rohmaterialverbrauch - gerecht zu werden, muß die Entwicklung eines neuen Verfahrens zur mikrobiellen Ethanolerzeugung folgenden Anforderungen genügen: $\cdot$ Erzielung hoher Raum-Zeit-Ausbeuten, $\cdot$ insterile Vergärung von billigen Abfallsubstraten und vollständige $\cdot$ Umsetzung zu Ethanol. Hierzu wurde ein kontinuierliches Wirbelschichtverfahren entwickelt, bei dem der Biokatalysator, das anaerobe Bakterium Zymomonas mobilis, in offenporigen Sinterglasträgern immobilisiert wird. Diese Immobilisierung, die auf der natürlichen Eigenschaft des eingesetzten Organismus zur Anheftung an Oberflächen beruht, muß unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Nachdem das Trägermaterial in der primären sterilen Kolonisierungsphase vollständig mit Zymomonas mobilis Bakterien besiedelt wurde, kann die eigentliche insterile Üroduktionsphase mit der Vergärung von Abfallsubstrat folgen. Die Stabilität des entwickelten Wirbelschichtverfahrens beruht auf der durch die Akkumulation vonZymomonas mobilis Bakterien im Wirbelschichtreaktor möglichen kurzen Verweilzeit der Flüssigphase im Reaktor, da ständig mit dem Zulauf eingeschleppte Kontaminanten wieder ausgespült werden. Da sich durch die Aufkonzentrierung der eingesetzten Mikroorganismen zu hohen lokalen Zelldichten im Trägermaterial die Reaktionsordnung des Prozesses aufgrund von Stofftransportlimitierungen erhöht, ist reaktionstechnisch eine Kaskadierung von Wirbelschichtreaktoren notwendig, um hohe Raum-Zeit-Ausbeuten bei nahezu vollständigem Umsatz zu erzielen. Die reaktionstechnisehen Untersuchungen zur Ethanolgärung mit immobilisierten Zymomonas mobilis Bakterien wurden in speziell entwickelten, autoklavierbaren 2,2 l Labor-Wirbelschiehtreaktoren und 55 bzw. 50 l Technikums-Wirbelschichtreaktoren durchgeführt. Zur Prozeßsteuerung und -regelung der Wirbelschichtanlagen wurde eine on-line Analytik für das Substrat Glukose (on-line Polarimeter) und das Produkt Ethanol (on-line Gaschromatograph) implementiert, sowie ein Personal Computer als Prozeßrechner eingesetzt. [...

Die Rolle der Reaktionstechnik in der mikrobiellen Verfahrensentwicklung

Die Bioverfahrenstechnik hat im besonderen Maße eine integrative Aufgabe zu erfüllen, um durch erfolgreiches Zusammenwirken von Biologen, Chemikern und Ingenieuren zu neuen und verbesserten Produktionsprozessen zu gelangen. Die reaktionstechnische Analyse biologischer Systeme ist ohne Zusammenwirken des Ingenieurwesens mit den Fachdisziplinen Biologie und Chemie nicht erfolgreich möglich. Die in Deutschland in dieser Intensität wohl einmalige Möglichkeit zur interdisziplinären Zusammenarbeit ist eine der Stärken der Institute für Biotechnologie der Forschungszentrum Jülich GmbH und hat wesentlich zum Entstehen dieser Arbeit beigetragen. Reaktionstechnische Arbeiten zur Verfahrensentwicklung sind wenig sinnvoll, wenn Reaktionen nicht auch in einem technisch relevanten Maßstab untersucht werden können. Die Möglichkeit zur Nutzung des Biotechnikums der Forschungszentrum Jülich GmbH mit seiner herausragenden technischen Ausstattung war eine wesentliche Grundlage der vorliegenden Arbeit. Reaktionstechnische Analysen biologischer Systeme sind darauf angewiesen, ausreichend Meßinformation zu erhalten. Die Möglichkeit, mit Hilfe der Kernresonanzspektroskopie ($\textit{nuclear magnetic resonance}$, NMR) Stoffkonzentrationen in lebenden Zellen zu messen, ohne diese zu zerstören, stellt eine wichtige Bereicherung des analytischen Methodenspektrums dar. Nur durch die intensive Zusammenarbeit mit der NMR-Arbeitsgruppe im Institut für Biotechnologie der Forschungszentrum Jülich GmbH unter der Leitung von Herrn Dr. de Graaf konnte diese Meßtechnik für reaktionstechnische Untersuchungen nutzbar gemacht werden. Die Automatisierung reaktionstechnischer Methoden und die Bereitstellung von Datenanalysewerkzeugen erfordert einen zum Teil erheblichen Programmieraufwand. Dieser wurde überwiegend von Doktoranden und Diplomanden geleistet. Ohne die intensive softwaretechnische Beratung, mathematische Unterstützung und auch Bereitstellung von einzelnen Softwarebausteinen durch Herrn Prof. Wiechert hätten diese Arbeiten nicht in diesem Umfang durchgeführt werden können. Die breite Anwendung der Reaktionstechnik in der mikrobiellen Verfahrensentwicklung kann besonders dann gelingen, wenn die entwickelten Methoden und Verfahren anderen verfügbar gemacht werden. Daher war ein wichtiger Aspekt dieser Arbeiten die Zusammenarbeit mit Industriepartnern (Anwendern und Lizenznehmern). Auch wenn sich dieser Technologietransfer aufgrund der Verpflichtung zur Geheimhaltung, oder weil es sich 'nur' um Mitarbeit bei der Entwicklung zur Marktreife handelte, nicht als wissenschaftliches Ergebnis in dieser Arbeit niederschlägt, so sind doch die Synergieeffekte nicht zu unterschätzen. Die mikrobielle Verfahrensentwicklung umfaßt nicht nur die technische Realisierung der eigentlichen Stoffumwandlung, sondern muß gleichzeitig die Isolierung des Produktes aus der Reaktionslösung ermöglichen. Ohne die simultane Entwicklung eines [...