Mikrobielle Sukzession in geflutetem Reisfeldboden

In der vorliegenden Arbeit wurde eine bakterielle Sukzession in einem Reisfeldboden in Abhängigkeit zum Sauerstoffgradienten, wie er sich nach Überflutung des Bodens ausbildet, mit einem kombinierten Ansatz von molekularbiologischen Methoden und Kultivierungsexperimenten analysiert. Als Modellsystem wurde unbepflanzter Reisfeldboden in Mikrokosmen bei 30 °C in Dunkelheit inkubiert. Mittels Mikrosensormessungen wurde gezeigt, dass sich bereits sechs Stunden nach dem Fluten ein steiler vertikaler Sauerstoffgradient entwickelt hatte und dieser über die weitere Inkubationsdauer stabil blieb. Die Struktur und Dynamik der bakteriellen Gemeinschaft in der oxischen Zone, der Übergangszone und der anoxischen Zone wurden mit der terminalen Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus (T-RFLP)-Analyse verfolgt. Als molekulare Marker wurden die 16S rRNA und ihr kodierendes Gen (16S rDNA) verwendet. Folgende Inkubationszeitpunkte wurden untersucht: ein und sechs Stunden sowie ein, zwei, sieben, 14, 21, 30, 42, 84 und 168 Tage. Zu den jeweiligen Inkubationszeitpunkten wurden aus Mikrokosmen Proben für die molekulare Analyse entnommen, die zu den oben genannten Sauerstoffzonen korrespondierten. Für jeden der Inkubationszeitpunkte wurde die Zusammensetzung der bakteriellen Lebensgemeinschaft in drei Mikrokosmen unabhängig voneinander analysiert. Eine Korrespondenzanalyse der gesamten Fingerprintmuster auf 16S rRNA- bzw. auf 16S rDNA-Ebene zeigte, dass die Faktoren Inkubationszeit und Sauerstoffkonzentration und die Interaktion der beiden Faktoren einen Effekt auf die bakterielle Gemeinschaft hatten. Die zeitlichen Dynamiken wurden durch die Analyse der RNA besser aufgelöst als durch die Analyse der DNA. Die bessere Auflösung auf RNA-Ebene ist dadurch erklärbar, dass der detektierbare RNA-Gehalt einer Population durch den Faktor Populationsgröße und vor allem durch den Faktor Aktivität bestimmt wird. Die bakterielle Sukzession konnte in drei Phasen unterschiedlicher Dynamiken eingeteilt werden. Phase I (eine Stunde bis zwei Tage nach Überflutung) zeigte die stärksten Umbrüche in der Zusammensetzung der bakteriellen Gemeinschaft. Diese Dynamiken waren ebenfalls in Phase II (zwei Tage bis 21 Tage nach Überflutung) zu beobachten, allerdings im Vergleich zur Phase I in schwächerer Ausprägung. Die Phase III (21 Tage bis 168 Tage nach Überflutung) war durch eine zeitlich und räumlich stabile Gemeinschaft gekennzeichnet. Mittels der vergleichenden Sequenzanalyse von 16S rRNA-Klonsequenzen wurden die mit den abundanten T-RFs korrespondierenden Organismen der Phase I in der oxischen Zone als Betaproteobacteria und in der anoxischen Zone als Clostridien identifiziert. Die Phase III wurde durch Nitrospira, Verrucomicrobia und Acidobacteria (oxische Zone) und Myxococcales (hauptsächlich in der anoxischen Zone) charakterisiert. Sowohl in Phase I als auch in Phase III wurden Vertreter der Betaproteobacteria als abundante Population detektiert. Basierend auf der gemeinsamen Interpretation der T-RFLP-Daten und der Klonsequenzen konnte eine Veränderung über die Inkubationszeit in der phylogenetischen Zusammensetzung innerhalb dieser Gruppe festgestellt werden. Aerobe Bakterien der Phase I und der Phase III wurden mittels Verdünnungsreihentechnik isoliert. Der Vergleich der Phylogenien der Isolate beider Phasen zeigte ebenfalls einen starken Umbruch in der kultivierbaren Fraktion über die Inkubationszeit. Während die kultivierbare Fraktion in der Phase I hauptsächlich durch Vertreter der Betaproteobacteria charakterisiert war, setzte sich die Phase III vor allem aus Mitgliedern des Phylums Alphaproteobacteria zusammen. Ferner wurden ausschließlich in der Phase III Acidobacteria spp. und Verrucomicrobia spp. isoliert. Isolate der Actinomycetales waren in beiden Phasen charakteristisch, wobei die Isolate der Phase I zu anderen Gattungen gehörten als die Isolate der Phase III. Die abnehmende Dynamik der bakteriellen Sukzession hin zu einer Klimaxgemeinschaft konnte mit dem Konzept der r-/K-Selektion erklärt werden. Gleiches galt für die bakteriellen Populationen, die für die frühe bzw. späte Inkubationsphase als charakteristisch identifiziert worden waren. Der von taxonomisch beschriebenen Organismen abgeleitete Phänotyp der detektierten Bakterien der Phase I zeichnet sich durch hohe Wachstumsraten aus, während Bakterien der Phase III durch eine Anpassung an geringe Substratkonzentrationen gekennzeichnet sind

Molekularbiologische Untersuchungen zu Funktion und Phylogenie methanotropher Bakterien

Die hier beschriebenen Studien dienten der Charakterisierung von methanotrophen Bakterien (MB) mittels molekular- und mikrobiologischer Techniken sowie mittels Methoden der angewandten Bioinformatik. Die Anwendung dieses Methoden-Bestecks auf verschiedene konkrete Fragestellungen schlägt sich im kumulativen Charakter dieser Arbeit nieder. Vorgestellt werden Arbeiten zu folgenden, voneinander abgegrenzt dargestellten Themen: i) Untersuchung der Verbreitung der pMMO-2, einer neuartigen paralogen Kopie der partikulären Methan-Monooxygenase (pMMO-1), eines Schlüsselenzyms der MB sowie die vergleichende Analyse der Operonstrukturen der für pMMO-1 bzw. pMMO-2 kodierenden Gene, ii) Charakterisierung der potenziell zu Methan hoch-affinen MB des "Upland Soil Cluster a" (USC a) mit Methoden der Metagenomik, iii) vergleichende Analyse der für Enzyme der N2-Fixierung kodierenden Gene nifH und nifD methanotropher Bakterien sowie iv) Entwicklung eines Computerprogramms für in silico tRFLP-Analysen sowie dessen Erprobung im Rahmen der populationsökologischen Charakterisierung einer MB-Population. i) Die kultivierten MB wurden aufgrund phylogenetischer, morphologischer und physiologischer Eigenschaften in Typ I, Typ II und Typ X MB eingeteilt. Anhand des für eine Untereinheit der pMMO-2 kodierenden pmoA2-Gens konnte die weite Verbreitung dieses bislang uncharakterisierten Enzyms innerhalb der Typ II MB dargestellt werden. Auffällig ist, daß manche MB pmoA2 nicht enthalten, obwohl das Gen für phylogenetisch wie physiologisch nah verwandte Organismen nachgewiesen wurde. pmoA2 wurde in keinem der untersuchten Typ I MB oder Typ X gefunden. Die Erstellung einer BAC-Bibliothek erlaubte die vergleichende Sequenzanalyse der für pMMO-1 bzw. pMMO-2 kodierenden Gene des Referenz-Organismus Methylocystis sp. Stamm SC2. Beide Operons bestehen aus drei Genen, die in der Reihenfolge pmoCAB organisiert sind. Im Zuge dieser Arbeit wurde die Anzahl bekannter pmo-Operons mehr als verdoppelt (vgl. Punkt ii). Die zuvor für Typ II und Typ X MB bekannte Gen-Anordnung ist somit bei allen bisher untersuchten MB hochkonserviert. Trotz deutlicher Sequenz-Unterschiede der kodierenden Gene ähnelt pMMO-2 sowohl hinsichtlich der Operon-Struktur als auch der abgeleiteten Aminosäure-Sequenz stark der pMMO-1. Vergleichende Analysen der abgeleiteten Sekundärstrukturen sowie hochkonservierter Aminosäuren führten dazu, daß der pMMO-2 die Funktion einer Methan-Monooxygenase zugeordnet werden konnte. Mittels der 5'-RACE-Technik wurde die Transkription der pMMO-2 nachgewiesen und die Promotoren beider Operons identifiziert. ii) Obwohl die biogene Oxidation atmosphärischen Methans nachgewiesen ist, wurden bis heute keine MB isoliert, die eine entsprechend hohe Affinität zu Methan aufweisen und die zu Wachstum unter atmosphärischen Methan-Konzentrationen befähigt sind. Die methanotrophe Population von als biogene Methan-Senken charakterisierten, aciden "Upland"-Böden wird durch Vertreter des USCa dominiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmals ein größeres genomisches Fragment eines Repräsentanten dieser bislang nicht kultivierten MB vergleichend analysiert. Dazu wurden die Methoden der Metagenomik etabliert und eine ca. 250.000 Klone umfassende Fosmid-Bibliothek aus Waldboden-DNA erzeugt. Mittels PCR-basierten Hochdurchsatz-Screenings konnten zwei Klone mit USCa-spezifischen Inserts identifiziert werden. Dabei diente der zentrale Bereich der pmoA als Markergen. In phylogenetischen Verrechnungen gruppieren partielle pmoA-Sequenzen des USCa gemeinsam mit dem pmoA-Gen des einzigen kultivierten Vertreters der Gattung Methylocapsa, M. acidiphila. Deshalb wurde eine Genom-Bibliothek von M. acidiphila konstruiert und ein 100 kb großes Fragment zu Referenzzwecken sequenziert. Die vergleichende Analyse der erzielten Sequenzen gegen ca. 200 vollständig sequenzierte prokaryotische Genome bestätigte die nahe Verwandschaft von USCa und M. acidiphila und ermöglichte die eindeutige Zuordnung der Mitglieder des USCa zu den Alphaproteobacteria. Die Analyse der für die pMMO kodierenden Gene ergab für beide Genom-Fragmente die Anordnung in einem Operon in der Reihenfolge pmoCAB. Die vergleichende Analyse der Primär- und Sekundärstruktur der abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen ergab keine Hinweise auf eine erhöhte Affinität der pMMO des USCa zu Methan, sondern hohe Übereinstimmungen mit den abgeleiteten Strukturen anderer pMMOs. Allerdings konnte stromabwärts des pmo-Operons ein Gen identifiziert werden, das sowohl bei M. trichosporium Stamm OB3b als auch bei den homologen AMO-Operons nitrifizierender Bakterien an gleicher Stelle lokalisiert ist und möglicherweise ein viertes Gen des pmo-Operons darstellt

Telmatocola sphagniphila gen. nov., sp. nov., a Novel Dendriform Planctomycete from Northern Wetlands

Members of the phylum Planctomycetes are common inhabitants of northern wetlands. We used barcoded pyrosequencing to survey bacterial diversity in an acidic (pH 4.0) Sphagnum peat sampled from the peat bog Obukhovskoye, European North Russia. A total of 21189 bacterial 16S rRNA gene sequences were obtained, of which 1081 reads (5.1%) belonged to the Planctomycetes. Two-thirds of these sequences affiliated with planctomycete groups for which characterized representatives have not yet been available. Here, we describe two organisms from one of these previously uncultivated planctomycete groups. One isolate, strain OB3, was obtained from the peat sample used in our molecular study, while another strain, SP2T (=DSM 23888T = VKM B-2710T), was isolated from the peat bog Staroselsky moss. Both isolates are represented by aerobic, budding, pink-pigmented, non-motile, spherical cells that are arranged in unusual, dendriform-like structures during growth on solid media. These bacteria are moderately acidophilic and mesophilic, capable of growth at pH 4.0–7.0 (optimum pH 5.0–5.5) and at 6–30°C (optimum 20–26°C). The preferred growth substrates are various heteropolysaccharides and sugars, the latter being utilized only if provided in low concentrations (≤0.025%). In contrast to other described planctomycetes, strains SP2T and OB3 possess weak cellulolytic potential. The major fatty acids are C16:1ω5c, C18:1ω5c, C16:0, and C18:0. Characteristic lipids are the n-C31 polyunsaturated alkene (9–10 double bonds) and C30:1/C32:1 (ω-1) hydroxy fatty acids. The G + C content of the DNA is 58.5–59.0 mol%. Strains SP2T and OB3 share identical 16S rRNA gene sequences, which exhibit only 86 and 87% similarity to those of Gemmata obscuriglobus and Zavarzinella formosa. Based on the characteristics reported here, we propose to classify these novel planctomycetes as representatives of a novel genus and species, Telmatocola sphagniphila gen. nov., sp. nov

Elemental Sulfur and Thiosulfate Disproportionation by Desulfocapsa sulfoexigens sp. nov., a New Anaerobic Bacterium Isolated from Marine Surface Sediment

A mesophilic, anaerobic, gram-negative bacterium, strain SB164P1, was enriched and isolated from oxidized marine surface sediment with elemental sulfur as the sole energy substrate in the presence of ferrihydrite. Elemental sulfur was disproportionated to hydrogen sulfide and sulfate. Growth was observed exclusively in the presence of a hydrogen sulfide scavenger, e.g., ferrihydrite. In the absence of a scavenger, sulfide and sulfate production were observed but no growth occurred. Strain SB164P1 grew also by disproportionation of thiosulfate and sulfite. With thiosulfate, the growth efficiency was higher in ferrihydrite-supplemented media than in media without ferrihydrite. Growth coupled to sulfate reduction was not observed. However, a slight sulfide production occurred in cultures incubated with formate and sulfate. Strain SB164P1 is the first bacterium described that grows chemolithoautotrophically exclusively by the disproportionation of inorganic sulfur compounds. Comparative 16S rDNA sequencing analysis placed strain SB164P1 into the delta subclass of the class Proteobacteria. Its closest relative is Desulfocapsa thiozymogenes, and slightly more distantly related are Desulfofustis glycolicus and Desulforhopalus vacuolatus. This phylogenetic cluster of organisms, together with members of the genus Desulfobulbus, forms one of the main lines of descent within the delta subclass of the Proteobacteria. Due to the common phenotypic characteristics and the phylogenetic relatedness to Desulfocapsa thiozymogenes, we propose that strain SB164P1 be designated the type strain of Desulfocapsa sulfoexigens sp. nov

Bacterial community changes in a paddy soil oxygen gradient, assessed by cultivation and mRNA expression profiling

Thesis about bacterial community changes in a paddy soil oxygen gradient, assessed by cultivation and mRNA expression profiling