Expression der Matrix-Metalloproteinasen MMP-2, -7, -9 und -13 und ihrer Inhibitoren TIMP-1, -2 und -3 in Plattenepithelkarzinomen des oberen Aerodigestivtraktes

Plattenepithelkarzinome des oberen Aerodigestivtraktes stehen in Europa an sechster Stelle in der Häufigkeit ihres Auftretens und weisen in fortgeschrittenen Stadien trotz moderner Behandlungsmethoden eine relativ geringe 5-Jahres-Überlebensrate auf. Diese ist vor allem auf die hohe, in der Regel lymphogene Metastasierungsfrequenz zurückzuführen. Um bereits präoperativ das Risiko einer möglichen Metastasierung und die Aggressivität des Tumorwachstums einzuschätzen, zielen die Bemühungen verschiedener Arbeitsgruppen auf die Etablierung molekularer Marker. Besonderes Interesse gilt hierbei seit einigen Jahren der Gruppe der Matrix-Metalloproteinasen. Matrix-Metalloproteinasen bezeichnen eine Familie substratspezifischer Endopeptidasen, denen ein Zinkionen-Komplex im aktiven Zentrum gemeinsam ist. Alle Mitglieder der Familie können, neben anderen biologischen Funktionen, Bestandteile der Extrazellularmatrix abbauen. Die Regulation dieser Enzyme verläuft auf verschiedenen Ebenen, unter anderem durch spezifische Inhibitoren der aktiven Enzyme, TIMPs. Aufgrund ihrer Fähigkeiten kommen Matrix-Metalloproteinasen und ihren Inhibitoren eine tragende Rolle in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen zu, so auch in der Ausbreitung und Metastasierung maligner Tumoren. Von besonderer Bedeutung ist dabei die Überwindung von Basalmembranen zur Metastasierung. Die MMPs -2 und -9 sind in der Lage, neben anderen Substraten das in Basalmembranen auftretende Kollagen IV abzubauen. Diese Fähigkeit besitzen die übrigen MMPs nicht. Auf diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Dissertation die RNA-Expression von MMP–2, -7, -9 und –13, sowie von TIMP–1, -2 und –3 in Plattenepithelkarzinomen des oberen Aerodigestivtraktes sowie in Plattenepithelkarzinom-Zelllinien untersucht. RNA aus 30 Gewebeproben und sieben Zelllinien wurde extrahiert, mit Hilfe von RT-PCR und Gel-Elektrophorese dargestellt, die Ergebnisse semiquantivativ erfasst und statistisch ausgewertet. MMP- und TIMP-RNA war sowohl in den Gewebeproben als auch in den Zelllinien nachweisbar. Von den MMPs war MMP–13 am häufigsten und stärksten nachweisbar, MMP-2 am schwächsten. Die drei TIMPs konnten in allen Fällen nachgewiesen werden. Statistisch signifikante Korrelationen fanden sich zwischen MMP-13 und dem Lymphknotenstatus, MMP-13 und TIMP-2, sowie MMP-9 und dem Fernmetatsasenstatus. Des weiteren ergaben sich Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen stärkeren MMP-2 und –9 RNA-Signalen und einem fortgeschrittenen Tumorstadium. Der Nachweis der betrachteten RNA in den Zelllinien war dem der Gewebeproben ähnlich; allerdings waren die Signale für die jeweilige RNA insgesamt schwächer. Korrelationen von MMP-Signalen mit Primärtumor-Lokalisationen ließen sich nicht aufweisen, ebenso wenig kongruente Muster innerhalb der MMP-Signale. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation zusammenfassend lässt sich eine Rolle der untersuchten MMPs und TIMPs für das Invasions- und Metastasierungsverhalten von Karzinomen der oberen Luft- und Speisewege annehmen. Ihr prognostisches Potential ist zum gegenwärtigen Zeitpunkt jedoch noch nicht abschließend geklärt

Cytoplasmic islet cell antibodies recognize distinct islet antigens in IDDM but not in stiff man syndrome

Cytoplasmic islet cell antibodies are well-established predictive markers of IDDM. Although target molecules of ICA have been suggested to be gangliosides, human monoclonal ICA of the immunoglobulin G class (MICA 1-6) produced from a patient with newly diagnosed IDDM recognized glutamate decarboxylase as a target antigen. Here we analyzed the possible heterogeneity of target antigens of ICA by subtracting the GAD-specific ICA staining from total ICA staining of sera. This was achieved 1) by preabsorption of ICA+ sera with recombinant GAD65 and/or GAD67 expressed in a baculovirus system and 2) by ICA analysis of sera on mouse pancreas, as GAD antibodies do not stain mouse islets in the immunofluorescence test. We show that 24 of 25 sera from newly diagnosed patients with IDDM recognize islet antigens besides GAD. In contrast, GAD was the only islet antigen recognized by ICA from 7 sera from patients with stiff man syndrome. Two of these sera, however, recognized antigens besides GAD in Purkinje cells. In patients with IDDM, non-GAD ICA were diverse. One group, found in 64% of the sera, stained human and mouse islets, whereas the other group of non-GAD ICA was human specific. Therefore, mouse islets distinguish two groups of non-GAD ICA and lack additional target epitopes of ICA besides GAD. Longitudinal analysis of 6 sera from nondiabetic ICA+ individuals revealed that mouse-reactive ICA may appear closer to clinical onset of IDDM in some individuals

Determination of islet cell antibodies using an ELISA system with a preparation of rat insulinoma (RIN A2) cells

An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was established for the detection of islet cell antibodies in human sera. The antigen was prepared from rat insulinoma (RIN A2) cells. Cells were dissociated in lysis buffer and the lysate was centrifuged at 100,000 x g. The supernatant was used to coat microtiter ELISA plates (10 micrograms protein/ml in PBS pH 7.2). Non-specific binding sites on the plates were blocked with 2% PBS-BSA. Human test sera were preabsorbed on separate plates using 2% PBS-BSA and incubated on precoated plates at an optimal dilution of 1/10 in 60 mM PBS for 60 min at 37 degrees C. Phosphatase-labeled anti-human IgG serum and phosphatase substrate were applied and the reaction was stopped by adding 3 M NaOH. Out of 90 sera from type I diabetic patients, 47 (52.2%) reacted in the new ELISA whereas none of 15 type II diabetics, 50 sera containing non-islet specific antibodies or 100 normal controls were positive. In the same group of patients, ICA were positive in 63.3%. When both, the ELISA and conventional ICA testing were applied, the number of positives was increased to 83%. The ICA-ELISA with the above described antigen preparation provides a well standardized and reproducible test method which is highly specific for type I diabetes. It may therefore be useful for large screening procedures

Prospektive Untersuchungen zu Ausmaß und Richtung der lymphogenen Metastasierung bei Patienten mit Karzinomen der oberen Luft- und Speisewege

Untersuchungen zu Richtung und Ausmaß der lymphogenen Metastasierung von Plattenepithelkarzinomen im Kopf-Hals Bereich weisen eine Vielzahl möglicher Fehlerquellen auf. Häufig fehlen Angaben über die angewandten Methoden oder die Lokalisation des Primärtumors. Noch schwieriger ist eine Beurteilung eines Ergebnisses, wenn die Beschreibung der Metastasenlokalisation ohne Hinweis auf die zugrunde liegenden Untersuchungsmethoden (z.B. Palpation, Bildgebung, histologische Aufarbeitung) geschieht. In der vorliegenden Studie wurden prospektiv relevante Parameter zur lymphogenen Metastasierung von Kopf-Hals Karzinomen dokumentiert. Lediglich Plattenepithelkarzinome mit bekanntem Primärtumor wurden eingeschlossen, Patienten bei denen nicht alle für diese Untersuchung relevanten Parameter dokumentiert waren dagegen ausgeschlossen. Wichtige Grundlage für die Studie waren die Untersuchungen, die zur Feststellung von Lokalisation und Ausmaß der Metastasierung beigetragen haben. Alle Patienten wurden präoperativ mit Palpation und Sonographie und 53,4% aller Patienten zusätzlich mit einer Feinnadelpunktion untersucht. Die histopathologische Aufarbeitung erfolgte nach zuvor festgelegten Standards, bei denen der intraoperativen und postoperativen Markierung des Neck dissection Präparates ein hoher Stellenwert zukam

Die S19 mRNS-Expression in Plattenepithelkarzinomen des oberen Aerodigestivtraktes

Ziel dieser Arbeit war die Analyse von Ausmaß, Häufigkeit und Charakter der mRNS-Expression des ribosomalen Proteins S19 (S19) in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC). Als Methode wurde die Reverse Transkription-Polymerase Chain Reaction mit spezifischen S19 Primern gewählt. Untersucht wurden 18 HNSCC Zelllinien im Vergleich mit 17 benignen Keratinozytenzelllinien sowie 30 HNSCC Gewebeproben im Vergleich mit 8 Referenz-Gewebeproben. Für den Vergleich der HNSCC Zelllinien mit den benignen Keratinozytenzelllinien konnten die DDRT-PCR Voruntersuchungen bestätigt werden: In den HNSCC Zelllinien fand sich eine signifikante S19 mRNS-Repression. Niedrige S19 mRNS-Level korrelierten mit einem stärker entdifferenzierten Zellbild. Für die Gewebe zeichnete sich eine ähnliche Tendenz ab - signifikante Ergebnisse konnten jedoch nicht ermittelt werden. Lediglich eine große Karzinomausbreitung korrelierte signifikant mit niedrigen S19 mRNS-Leveln, wodurch die für die Zelllinien gewonnenen Ergebnisse gestützt werden. Um zu prüfen, ob die S19 mRNS-Repression lediglich auf veränderte Ribosomenzahlen zurückzuführen war, wurden zwei weiterer ribosomale Proteine, S6 und S14, mit derselben Methodik untersucht. Die mRNS-Expressionslevel aller drei ribosomalen Proteine zeigten hohe Korrelationen. Dies spricht für einen Zusammenhang der ribosomalen Rolle des S19 mit seiner mRNS-Repression in HNSCC. Die Ursachen der S19 mRNS-Repression in HNSCC wurden im Rahmen dieser Arbeit nicht näher untersucht. Ungeklärt bleibt die Frage, ob die S19 mRNS-Repression Ursache oder Folge der malignen Degeneration ist und ob ribosomale oder extraribosomale Funktionen des S19 betroffen sind. Weitere Untersuchungen sind nötig, um einen möglichen Einsatz des S19 als Tumormarker und Verlaufsparameter oder aber Zielprotein für therapeutische Interventionen abzuklären

Epidemiology and immunogenetic background of islet cell antibody - positive nondiabetic schoolchildren : Ulm-Frankfurt population study

Islet cell antibodies (ICAs) were determined in a large cohort of white nondiabetic schoolchildren (n = 4287) from a homogenous population in southern Germany. The prevalence of ICA levels greater than or equal to 5 Juvenile Diabetes Foundation (JDF) U was 1.05% (95% confidence interval 0.8-1.4%). Analysis of HLA-DR beta and -DQ beta alleles revealed that the specificities found to be increased in insulin-dependent (type I) diabetic subjects with the same ethnic background were also associated with ICA positivity in the nondiabetic schoolchildren. HLA-DR3 (P less than 0.01) and -DR4 (P less than 0.01) phenotypes and absence of Asp residue (P less than 0.01) at codon 57 of the HLA-DQ beta-chain were significantly increased in ICA+ compared with control subjects. High levels of ICAs, which were categorized as either greater than or equal to 17 or greater than or equal to 30 JDF U, were found to be associated with amino acids other than Asp at position 57 of the HLA-DQ beta-chain. No association of ICA level was found for HLA-DR phenotypes

Baculovirus-Mediated Expression of Human 65 kDa and 67 kDa Glutamic Acid Decarboxylases in SF9 Insect Cells and Their Relevance in Diagnosis of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus

cDNAs coding for the full-length human 65 and 67 kDa glutamic acid decarboxylases (GAD65 and GAD67) were amplified from pancreas and hippocampus cDNA libraries by polymerase chain reaction, respectively. Both cDNAs were inserted into a baculovirus vector which mediated highly efficient expression of the human GAD65 and GAD67 with histidine-hexapeptides as affinity ligands at their C-termini in Spodoptera frugiperda (Sf9) cells. The recombinant GAD proteins were purified to homogeneity by affinity chromatography using a metal-chelating matrix. The infected Sf9 insect cells expressed the recombinant human GAD65 and GAD67 with natural-like conformations, as confirmed by measurement of their enzyme activities as well as their fully restored autoantigenicities. Immunoprecipitation of metabolically labeled infected Sf9 cells demonstrated the autoantigenic potential of the recombinant GAD proteins. The practicability of using recombinant GAD65 and GAD67 derived from the baculovirus expression system for the development of an immunoassay for the diagnosis of insulin-dependent diabetes mellitus is discussed

Salvage surgery for head and neck squamous cell carcinoma

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