Additive Manufacturing in Biotechnology : Methods, Inks and Analytics for Biocatalytic Applications of Extrusion-Based 3D Bioprinting

In den letzten zehn Jahren hat sich die Additive Fertigung (AM) von einer spezialisierten Nischenanwendung zu einem weit verbreiteten Standardwerkzeug entwickelt, das in vielen Bereichen der Forschung und Industrie unverzichtbar geworden ist. Dank neuer Technologien und Materialien, die die Herstellung hochwertiger Produkte ermöglichen, ist AM nicht nur für das schnelle Anfertigen von Prototypen relevant, sondern auch für die Herstellung von Produkten für Endverbraucher. Vor allem bei Produkten mit hohem Bedarf für kundenspezifische Anpassungen oder bei Produkten mit hoher geometrischer Komplexität können AM-Methoden als sinnvolle Alternative zu anderen Fertigungsverfahren in Betracht gezogen werden. In der Medizin und Bioverfahrenstechnik wird AM typischerweise für Anwendungen wie die Herstellung von Zahnimplantaten und Zahnschienen oder für maßgeschneiderte Laborgeräte, mikrofluidische Systeme und sogar Chromatographiesäulen eingesetzt. Die Kombination von biologischen Materialien und lebenden Zellen mit AM-Methoden hat dazu geführt, dass sich das Bioprinting als eigenständiger Bereich mit neuen Möglichkeiten und Herausforderungen etabliert hat. Bioprinting-Methoden ermöglichen die Herstellung von Objekten aus weichen, wasserbasierten Materialien, die sich für den physikalischen Einschluss von Enzymen eignen. Dadurch können biokatalytische Reaktoren direkt mit enzymhaltigen Tinten gedruckt werden. Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, neue Werkzeuge für die Herstellung biokatalytisch aktiver Materialien zu schaffen, wobei der Schwerpunkt auf extrusionsbasiertem Bioprinting liegt. Neuartige Tinten werden in Kombination mit speziell angepassten Druckmethoden etabliert, um eine verbesserte Druckbarkeit zu erreichen. Um die Eignung der verschiedenen Materialien hinsichtlich der resultierenden biokatalytischen Aktivität zu bewerten, werden mikroplattenbasierte Aktivitätsassays mit zwei verschiedenen Enzymen und einer Reihe von 3D-gedruckten Materialien durchgeführt. Die Tinten und Hydrogele werden mit einer Reihe weiterer Analysemethoden wie Rheologie, mechanischen Tests oder Rasterelektronenmikroskopie charakterisiert. Um die Durchlässigkeit von Hydrogelen für Substratmoleküle zu bestimmen, wird eine auf Mikrofluidik basierende Methode zur Abschätzung von Diffusionskoeffizienten in Hydrogelen entwickelt. Als allgemeiner Beitrag zur Verbesserung der Prozessüberwachung und -steuerung beim extrusionsbasierten Bioprinting wird eine PID-basierte Drucksteuerung etabliert, um einen konstanten und reproduzierbaren Tintenfluss zu erzeugen. In einer ersten Studie wurde ein neuartiges Materialsystem für das Drucken enzymatisch aktiver Strukturen etabliert, indem hochkonzentrierte Emulsionen (high internal phase emulsions -- HIPEs) als Tinten verwendet wurden. HIPEs sind Emulsionen, die mindestens 74 % (v/v) an innerer Phase enthalten, was der dichtesten möglichen Packung von Tröpfchen entspricht, bevor eine Verformung eintritt. Als äußere Phase der HIPEs wurden polymerisierbare ölige Monomere verwendet und der wässrigen inneren Phase wurden Poly(ethylenglycol)diacrylat und Acrylsäure zugesetzt. Auch öl- bzw. wasserlösliche Photoinitiatoren wurden den jeweiligen Phasen zugesetzt. Die Polymerisation der Tinten führte zur Bildung eines offenporigen Polymergerüsts, das mit untereinander vernetzten Hydrogeltröpfchen gefüllt ist. Dieser Ansatz ermöglicht die Herstellung von Kompositmaterialien mit hydrogelähnlichen Eigenschaften wie der Durchlässigkeit für Substrat- und Produktmoleküle bei gleichzeitig höherer mechanischer Stabilität aufgrund der stützenden Wirkung des Polymergerüsts. Tinten für den extrusionsbasierten 3D-Druck als Emulsionen zu formulieren bringt deutliche Vorteile hinsichtlich der rheologischen Eigenschaften der Tinten, da Emulsionen aufgrund ihrer Fließgrenze ideal für Extrusionsdruck geeignet sind. Um die Herstellung kleiner Volumina von HIPEs zu ermöglichen, wurde ein maßgeschneiderter Aufbau auf der Grundlage eines 3D-gedruckten spiralförmigen Rührblatts entwickelt, der die Herstellung von HIPEs in 50-mL-Falcon-Röhrchen ermöglichte. Durch die Minimierung von Materialverlust erlaubte die Produktion in kleinem Maßstab die Zugabe des Enzyms β-Galactosidase. Rheologische Messungen mit einer Reihe verschiedener HIPE-Zusammensetzungen zeigten, dass HIPEs mit einem hohen Anteil an Tensid in der äußeren Phase und mit einem hohen Volumenanteil an innerer Phase eine höhere Fließgrenze aufwiesen, was als Indikator für Druckbarkeit gilt. Im Allgemeinen wiesen die hergestellten HIPEs hervorragende rheologische Eigenschaften auf. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass sowohl die äußere, als auch die innere Phase der HIPEs polymerisiert werden konnte. Ein Versuchsaufbau mit vier um die Extrusionskanüle des Biodruckers herum angeordneten UV-LEDs wurde entwickelt, um die Polymerisation der Tinten während der Extrusion zu ermöglichen, was das Zerlaufen des Materials reduziert und so die Druckqualität weiter verbessert. Es wurden Hohlzylinder mit enzymhaltiger Tinte gedruckt, um Aktivitätsmessungen in 48-Well-Mikroplatten durchzuführen. Die Ergebnisse zeigten, dass die HIPEs biokatalytisch aktiver waren, wenn sie große Mengen an Monomer in der wässrigen Phase und einen hohen Volumenanteil an wässriger Phase enthielten. Die Anwesenheit von mindestens 7 % (v/v) Monomer in der wässrigen Phase führte zu einer mehr als fünffachen Steigerung der gemessenen Aktivität im Vergleich zu HIPEs ohne Monomer in der wässrigen Phase. Der Durchmesser der Extrusionskanüle konnte als weiterer wichtiger Parameter identifiziert werden, der die resultierende Aktivität beeinflusst. Diese Beobachtung könnte auf die durch das Trägermaterial bedingte Verringerung des Stofftransports zurückzuführen sein, die ein hohes Verhältnis von Oberfläche zu Volumen allgemein vorteilhaft macht. Um ein breiteres Spektrum an Tintentypen abzudecken, wurden in der zweiten und dritten Studie dieser Arbeit Tinten auf der Basis von Agarose und Agar untersucht. Diese Tinten wiesen im Vergleich zu HIPEs deutlich andere Materialeigenschaften auf, sowohl im flüssigen Zustand als Tinte, als auch im verfestigten Zustand als Hydrogel. Um den Anforderungen dieser Tinten gerecht zu werden, wurden der Versuchsaufbau für den Druck und die eingesetzten Analyseverfahren speziell an die untersuchten Tinten angepasst. Die Durchlässigkeit für Substrat- und Produktmoleküle wurde als eine der wichtigsten Eigenschaften der Materialien hinsichtlich ihrer Eignung für die Immobilisierung von Enzymen identifiziert. Daher wurde eine auf Mikrofluidik basierende Methode zur Schätzung des Diffusionskoeffizienten eines Analyten in transparenten Hydrogelen entwickelt. Ein mikrofluidischer Chip mit drei Einlässen und einer Y-Verzweigung wurde verwendet, um eine Grenzfläche zwischen dem zu untersuchenden Hydrogel und einer Analytlösung zu schaffen. Zu diesem Zweck wurde flüssige Tinte bei erhöhter Temperatur von einer Seite in den Chip injiziert, bis sie die Y-Verzweigung erreichte. Nach dem Ausgelieren der Tinte wurde die Analytlösung durch einen der anderen Einlässe injiziert und die Diffusion des Analyten durch das Hydrogel wurde mit einem UV-Flächendetektor überwacht. Die Diffusionskoeffizienten konnten durch das Fitten der gemessenen Konzentrationsprofile des Analyten entlang des mikrofluidischen Kanals mit einer analytischen Lösung des zweiten Fick\u27schen Diffusionsgesetzes geschätzt werden. In einer Fallstudie wurde der Diffusionskoeffizient von Lysozym in einer Reihe von Hydrogelen bestimmt und verglichen. Die untersuchten Hydrogele bestanden aus unterschiedlichen Konzentrationen von unmodifizierter Agarose bzw. modifizierter Hydroxyethylagarose mit niedrigem Schmelzpunkt. Es wurde festgestellt, dass der Diffusionskoeffizient von 5(6)-Carboxyfluorescein in unmodifizierten Agarosehydrogelen etwas höher war als in Agarosehydrogelen mit niedrigem Schmelzpunkt. Dies stimmt gut mit der theoretischen Vorhersage überein, dass das Polymernetzwerk von Hydrogelen aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt kleinere Porengrößen aufweist. Der gleiche Trend wurde für die Polymerkonzentration festgestellt, wobei höhere Konzentrationen mit niedrigeren Diffusionskoeffizienten und kleineren Poren einhergingen. In einer dritten Studie wurden Tinten auf Basis von Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt und Agar als weniger komplexe Alternative zu Tinten auf HIPE-Basis untersucht. Das Gelierungsverhalten von Agarose- und Agarbasierten Tinten erforderte einen anderen Versuchsaufbau für den Druck als die photopolymerisierbaren HIPEs. Eine beheizbare Düse, bestehend aus einem 3D-gedruckten Metallkörper, einem Temperatursensor und einem Heizdraht, wurde in den Aufbau implementiert, um sicherzustellen, dass die Tinten in flüssigem Zustand bei einer definierten Temperatur extrudiert werden konnten. Die Tinten wurden auf ein gekühltes Substrat extrudiert, um den Gelierungsprozess zu beschleunigen und das Zerlaufen der Tinte zu reduzieren. Obwohl das individuell an die Tinten angepasste Equipment die Druckbarkeit im Vergleich zu früheren Studien mit agarosebasierten Tinten deutlich verbesserte, war sie der Druckbarkeit von HIPEs immer noch drastisch unterlegen, sowohl hinsichtlich der erzeugten Strangdicke, als auch bzgl. der erreichbaren geometrischen Komplexität. Es konnten nur einfache Gitterstrukturen ohne Überhänge gedruckt werden. Eine Polymerkonzentration von mindestens 4,5 % (w/w) erwies sich als vorteilhaft für den Druck, wobei Gitterstrukturen mit einer Höhe von 2 cm druckbar waren. Mit rheologischen Methoden wurden die Tinten auf ihre Fließeigenschaften sowie ihr Schmelz- und Gelierverhalten untersucht. Die Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt zeigte im Vergleich zu den Agartinten wie erwartet deutlich reduzierte Gelier- und Schmelztemperaturen. Die verfestigten Hydrogele wurden einer mechanischen Prüfung unterzogen. Eine Reihe der in den vorherigen Studien etablierten Analysemethoden wurden erneut angewandt, um die Hydrogele auf Agarose- und Agarbasis im Hinblick auf ihre Anwendung für die Immobilisierung von Enzymen zu bewerten. Zu diesem Zweck wurde den Tinten vor dem Druck das thermostabile Enzym Esterase 2 aus Alicyclobacillus acidocaldarius zugegeben. Zur Messung der enzymatischen Aktivität und des Auswaschens von Enzym aus den gedruckten Hydrogelproben wurden mikrotiterplattenbasierte Aktivitätsassays verwendet. Die mikrofluidikbasierte Methode zur Bestimmung von Diffusionskoeffizienten wurde eingesetzt, um die Durchlässigkeit der Hydrogele für 5(6)-Carboxyfluorescein zu bestimmen. Es wurde festgestellt, dass die agarbasierten Hydrogele eine höhere Diffusionsfähigkeit und Aktivität aufwiesen, aber auch eine erhöhte Auswaschung von Enzym. Die Tendenz zum Auswaschen des Enzyms zeigte nicht nur die mangelnde Eignung von agarbasierten Hydrogelen für den Einsatz in durchströmten Reaktoren, sondern erklärt auch die scheinbar positiven Ergebnisse bei den durchgeführten Aktivitätsassays, da das ausgewaschene Enzym nicht mehr denselben Stofftransportbeschränkungen ausgesetzt ist wie immobilisiertes Enzym und dadurch eine höhere Aktivität aufweist. Aufgrund der geringen Auswaschung von Enzym und der akzeptablen Druckbarkeit wurden Agarosetinten mit einer Konzentration von mindestens 4,5 % (w/w) als geeignete Tinten für die Anwendung in biokatalytischen Reaktoren empfohlen. Unabhängig vom Tintentyp zeigten die bisherigen Studien einen allgemeinen Mangel an Reproduzierbarkeit bei pneumatischen Bioprinting-Verfahren, der auf schwankende und schlecht reproduzierbare Flussraten bei der Extrusion der Tinten zurückzuführen ist. Es wurde vermutet, dass neben der Viskosität der Tinte und dem Extrusionsdruck noch zusätzliche Faktoren wie der Füllstand der Kartusche, die teilweise Verstopfung der Düsen und Inhomogenitäten der Tinte die Extrusionsflussrate beeinflussen und Unregelmäßigkeiten in den Druckergebnissen verursachen. Unterschiede zwischen verschiedenen Tintenchargen und Temperaturschwankungen, die die Viskosität der Tinte beeinflussen, stellten eine zusätzliche Herausforderung dar. In der Studie zu agarose- und agarbasierten Tinten wurde jede gedruckte Probe gewogen, bevor sie für Aktivitätsmessungen verwendet wurde, und verworfen, wenn sie das vorgegebene Zielgewicht nicht innerhalb einer bestimmten Fehlertoleranz erreichte. Falls erforderlich, wurde der Extrusionsdruck manuell angepasst, um die Vergleichbarkeit der gedruckten Proben zu gewährleisten. Infolgedessen wurde eine Studie initiiert, um eine Inline-Prozessüberwachung für die Durchflussrate als wesentlichen Prozessparameter zu etablieren und eine automatisierte und reproduzierbare Methode zu entwickeln, um eine konstante Zielflussrate zu erzeugen, indem der Extrusionsdruck auf der Grundlage von Echtzeitflussdaten kontinuierlich angepasst wird. Um die benötigten Daten in einer Inline-Messung zu erhalten, wurde ein Durchflusssensor in den Aufbau eines pneumatischen Biodruckers mittels einer 3D-gedruckten Halterung integriert. Für die Kommunikation mit dem Flusssensor und die Verarbeitung der gemessenen Daten wurde ein auf Python basierendes Softwaretool entwickelt. Eine PID-Regelung wurde implementiert und mit den Echtzeit-Durchflussdaten gespeist. Auf Grundlage der eingespeisten Daten passte die Software den Extrusionsdruck des Druckers kontinuierlich an. Es wurden drei verschiedene Fallstudien durchgeführt, um die Leistung der PID-Regelung zu bewerten: a) Kontinuierliche Extrusion: Mehrere Durchläufe mit kontinuierlicher Extrusion zeigten, dass die automatische Druckanpassung erfolgreich eine vorgegebene Zielflussrate unabhängig vom Benutzer einstellen konnte. Im Vergleich zur konstanten Druckeinstellung erwies sich die adaptive Druckregelung als effektiv bei der Kompensation von umwelt- oder systembedingten Einflüssen wie Verstopfungen der Extrusionskanüle. b) Anpassung an Tinteninhomogenitäten: Ein realistischerer Anwendungsfall wurde untersucht, indem Hohlzylinder mittels einer Kartusche gedruckt wurden, die mit Schichten aus zwei unterschiedlich konzentrierten Poloxamer-407-Tinten gefüllt war, um Tinteninhomogenitäten zu simulieren. Die adaptive Druckregelung erwies sich als wirksam, eine konstante Durchflussrate zu erzeugen, indem der Druck während des Druckvorgangs entsprechend angepasst wurde. Dadurch konnten relativ gleichmäßige Zylinder gedruckt werden, während die konstante Druckeinstellung zu Zylindern mit stark voneinander abweichenden Wandstärken führte. c) Prozessübertragung auf andere Düsentypen: Um die Übertragbarkeit von Prozessen zwischen verschiedenen Versuchsaufbauten zu demonstrieren, wurden Testdrucke mit drei verschiedenen Typen von Extrusionskanülen mit gleichem Öffnungsdurchmesser durchgeführt. Die adaptive Druckregelung war in der Lage, mit allen drei Extrusionskanülen innerhalb von 30 bis 60 s die gewünschte Zielflussrate zu erzeugen. Die resultierenden Zylinder waren von gleichbleibender Qualität, unabhängig von der Kanüle. Beim Drucken mit konstanter Druckeinstellung wurde entweder zu wenig oder zu viel Tinte extrudiert, wenn der Druck nicht speziell für den entsprechenden Typ von Kanüle festgelegt wurde. Es wurde gezeigt, dass die PID-gesteuerte adaptive Druckregelung dazu beitragen kann, das extrusionsbasierte Bioprinting zuverlässiger zu machen und die Notwendigkeit umfangreicher Parameter-Screenings bei der Prozessentwicklung zu verringern. Die vorliegende Arbeit demonstriert neue Methoden für das Drucken von biokatalytisch aktiven Materialien. Es werden neuartige Tinten mit individuell angepassten Druckverfahren und analytischen Techniken vorgestellt. Die Anwendung von emulsionsbasierten Tinten zeigt die große Bandbreite an Materialien, die in Kombination mit Enzymen eingesetzt werden können. Materialscreenings können durch den Einsatz von Aktivitätsassays im Mikrotiterplattenformat beschleunigt werden. Die speziell für jede Tintenart angepassten Druckmethoden zeigen die Notwendigkeit einer Feinabstimmung zwischen Tinte und Druckverfahren. Der universelle Ansatz zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit im pneumatischen Bioprinting unter Verwendung einer PID-basierten Druckregelung könnte auch für Anwendungen außerhalb der Biokatalyse von Nutzen sein

Investigation of Lysozyme Diffusion in Agarose Hydrogels Employing a Microfluidics-Based UV Imaging Approach

Hydrogels are polymer-based materials with a high water content. Due to their biocompatible and cell-friendly nature, they play a major role in a variety of biotechnological applications. For many of these applications, diffusibility is an essential property influencing the choice of material. We present an approach to estimate diffusion coefficients in hydrogels based on absorbance measurements of a UV area imaging system. A microfluidic chip with a y-junction was employed to generate a fluid-hydrogel interface and the diffusion of lysozyme from the fluid into the hydrogel phase was monitored. Employing automated image and data processing, analyte concentration profiles were generated from the absorbance measurements and fits with an analytical solution of Fick’s second law of diffusion were applied to estimate diffusion coefficients. As a case study, the diffusion of lysozyme in hydrogels made from different concentrations (0.5–1.5% (w/w)) of an unmodified and a low-melt agarose was investigated. The estimated diffusion coefficients for lysozyme were between 0.80 ± 0.04×10$^{-10}$ m$^{2}$ s$^{-1}$ for 1.5% (w/w) low-melt agarose and 1.14 ± 0.02×10$^{-10}$ m$^{2}$ s$^{-1}$ for 0.5% (w/w) unmodified agarose. The method proved sensitive enough to resolve significant differences between the diffusion coefficients in different concentrations and types of agarose. The microfluidic approach offers low consumption of analyte and hydrogel and requires only relatively simple instrumentation

Automated and dynamic extrusion pressure adjustment based on real-time flow rate measurements for precise ink dispensing in 3D bioprinting

Extrusion-based printing relying on pneumatic dispensing systems is the most widely employed tool in bioprinting. However, standardized and reliable methods for process development, monitoring and control are still not established. Suitable printing parameters are often determined in a trial-and-error approach and neither process monitoring nor real-time adjustments of extrusion pressure to environmental and process-related changes are commonly employed. The present study evaluates an approach to introduce flow rate as a main process parameter to monitor and control extrusion-based bioprinting. An experimental setup was established by integrating a liquid flow meter between the cartridge and nozzle of a pneumatically driven bioprinter to measure the actual flow of dispensed ink in real-time. The measured flow rate was fed to a Python-based software tool implementing a proportional-integral-derivative (PID) feedback loop that automatically and dynamically adapted the extrusion pressure of the bioprinter to meet a specified target flow rate. The performance of the employed experimental setup was evaluated with three different model inks in three application examples. a) Continuous dispensing: Several runs of continuous dispensing showed that the PID-based pressure control was able to generate a steady flow rate more consistently and precisely than constant pressure settings. b) Adaptation to ink inhomogeneities: Deliberately created ink inhomogeneities were successfully compensated for by real-time pressure adjustments which profoundly enhanced the printing quality compared to printing without adaptive pressure. c) Process transfer to other nozzle types: Experiments with different nozzle types demonstrated the potential of the established setup to facilitate and accelerate process transfer and development. The present study provides an alternative approach for process design, monitoring and control by introducing flow rate as a main process parameter. We propose bioprinting processes to be based on flow rate specifications instead of constant pressure settings. This approach has the potential to save time by avoiding tedious parameter screenings and to introduce an active, real-time control over the printing process. Subjective influences by individual users during process development can be reduced and the process transfer between different devices and experimental setups can be facilitated and accelerated

Accelerating Generalized Linear Models by Trading off Computation for Uncertainty

Bayesian Generalized Linear Models (GLMs) define a flexible probabilistic framework to model categorical, ordinal and continuous data, and are widely used in practice. However, exact inference in GLMs is prohibitively expensive for large datasets, thus requiring approximations in practice. The resulting approximation error adversely impacts the reliability of the model and is not accounted for in the uncertainty of the prediction. In this work, we introduce a family of iterative methods that explicitly model this error. They are uniquely suited to parallel modern computing hardware, efficiently recycle computations, and compress information to reduce both the time and memory requirements for GLMs. As we demonstrate on a realistically large classification problem, our method significantly accelerates training by explicitly trading off reduced computation for increased uncertainty.Comment: Main text: 10 pages, 6 figures; Supplements: 13 pages, 2 figure

3D-Printable and Enzymatically Active Composite Materials Based on Hydrogel-Filled High Internal Phase Emulsions

The immobilization of enzymes in biocatalytic flow reactors is a common strategy to increase enzyme reusability and improve biocatalytic performance. Extrusion-based 3D bioprinting has recently emerged as a versatile tool for the fabrication of perfusable hydrogel grids containing entrapped enzymes for the use in such reactors. This study demonstrates the suitability of water-in-oil high internal phase emulsions (HIPEs) as 3D-printable bioinks for the fabrication of composite materials with a porous polymeric scaffold (polyHIPE) filled with enzyme-laden hydrogel. The prepared HIPEs exhibited excellent printability and are shown to be suitable for the printing of complex three-dimensional structures without the need for sacrificial support material. An automated activity assay method for the systematic screening of different material compositions in small-scale batch experiments is presented. The monomer mass fraction in the aqueous phase and the thickness of printed objects were found to be the most important parameters determining the apparent activity of the immobilized enzyme. Mass transfer limitations and enzyme inactivation were identified as probable factors reducing the apparent activity. The presented HIPE-based bioinks enable the fabrication of flow-optimized and more efficient biocatalytic reactors while the automated activity assay method allows the rapid screening of materials to optimize the biocatalytic efficiency further without time-consuming flow-through experiments involving whole printed reactors

3D-Printed Phenacrylate Decarboxylase Flow Reactors for the Chemoenzymatic Synthesis of 4-Hydroxystilbene

Continuous flow systems for chemical synthesis are becoming a major focus in organic chemistry and there is a growing interest in the integration of biocatalysts due to their high regio- and stereoselectivity. Methods established for 3D bioprinting enable the fast and simple production of agarose-based modules for biocatalytic reactors if thermally stable enzymes are available. We report here on the characterization of four different cofactor-free phenacrylate decarboxylase enzymes suitable for the production of 4-vinylphenol and test their applicability for the encapsulation and direct 3D printing of disk-shaped agarose-based modules that can be used for compartmentalized flow microreactors. Using the most active and stable phenacrylate decarboxylase from Enterobacter spec. in a setup with four parallel reactors and a subsequent palladium(II) acetate-catalysed Heck reaction, 4-hydroxystilbene was synthesized from p-coumaric acid with a total yield of 14.7 % on a milligram scale. We believe that, due to the convenient direct immobilization of any thermostable enzyme and straightforward tuning of the reaction sequence by stacking of modules with different catalytic activities, this simple process will facilitate the establishment and use of cascade reactions and will therefore be of great advantage for many research approaches

Systematic evaluation of agarose- and agar-based bioinks for extrusion-based bioprinting of enzymatically active hydrogels

Extrusion-based 3D bioprinting enables the production of customized hydrogel structures that can be employed in flow reactors when printing with enzyme-containing inks. The present study compares inks based on either low-melt agarose or agar at different concentrations (3–6%) and loaded with the thermostable enzyme esterase 2 from the thermophilic organism Alicyclobacillus acidocaldarius (AaEst2) with regard to their suitability for the fabrication of such enzymatically active hydrogels. A customized printer setup including a heatable nozzle and a cooled substrate was established to allow for clean and reproducible prints. The inks and printed hydrogel samples were characterized using rheological measurements and compression tests. All inks were found to be sufficiently printable to create lattices without overhangs, but printing quality was strongly enhanced at 4.5% polymer or more. The produced hydrogels were characterized regarding mechanical strength and diffusibility. For both properties, a strong correlation with polymer concentration was observed with highly concentrated hydrogels being more stable and less diffusible. Agar hydrogels were found to be more stable and show higher diffusion rates than comparable agarose hydrogels. Enzyme leaching was identified as a major drawback of agar hydrogels, while hardly any leaching from agarose hydrogels was detected. The poor ability of agar hydrogels to permanently immobilize enzymes indicates their limited suitability for their employment in perfused biocatalytic reactors. Batch-based activity assays showed that the enzymatic activity of agar hydrogels was roughly twice as high as the activity of agarose hydrogels which was mostly attributed to the increased amount of enzyme leaching. Agarose bioinks with at least 4.5% polymer were identified as the most suitable of the investigated inks for the printing of biocatalytic reactors with AaEst2. Drawbacks of these inks are limited mechanical and thermal stability, not allowing the operation of a reactor at the optimum temperature of AaEst2 which is above the melting point of the employed low-melt agarose

3D‐Printed Phenacrylate Decarboxylase Flow Reactors for the Chemoenzymatic Synthesis of 4‐Hydroxystilbene

Continuous flow systems for chemical synthesis are becoming a major focus in organic chemistry and there is a growing interest in the integration of biocatalysts due to their high regio‐ and stereoselectivity. Methods established for 3D bioprinting enable the fast and simple production of agarose‐based modules for biocatalytic reactors if thermally stable enzymes are available. We report here on the characterization of four different cofactor‐free phenacrylate decarboxylase enzymes suitable for the production of 4‐vinylphenol and test their applicability for the encapsulation and direct 3D printing of disk‐shaped agarose‐based modules that can be used for compartmentalized flow microreactors. Using the most active and stable phenacrylate decarboxylase from Enterobacter spec. in a setup with four parallel reactors and a subsequent palladium(II) acetate‐catalysed Heck reaction, 4‐hydroxystilbene was synthesized from p‐coumaric acid with a total yield of 14.7 % on a milligram scale. We believe that, due to the convenient direct immobilization of any thermostable enzyme and straightforward tuning of the reaction sequence by stacking of modules with different catalytic activities, this simple process will facilitate the establishment and use of cascade reactions and will therefore be of great advantage for many research approaches

Low-Dose Near-Infrared Light-Activated Mitochondria-Targeting Photosensitizers for PDT Cancer Therapy

Phthalocyanines (Pcs) are promising candidates for photodynamic therapy (PDT) due to their absorption in the phototherapeutic window. However, the highly aromatic Pc core leads to undesired aggregation and decreased reactive oxygen species (ROS) production. Therefore, short PEG chain functionalized A3B type asymmetric Pc photosensitizers (PSs) were designed in order to decrease aggregation and increase the aqueous solubility. Here we report the synthesis, characterization, optical properties, cellular localization, and cytotoxicity of three novel Pc-based agents (LC31, MLC31, and DMLC31Pt). The stepwise functionalization of the peripheral moieties has a strong effect on the distribution coefficient (logP), cellular uptake, and localization, as well as photocytotoxicity. Additional experiments have revealed that the presence of the malonic ester moiety in the reported agent series is indispensable in order to induce photocytotoxicity. The best-performing agent, MLC31, showed mitochondrial targeting and an impressive phototoxic index (p.i.) of 748 in the cisplatin-resistant A2780/CP70 cell line, after a low-dose irradiation of 6.95 J/cm2. This is the result of a high photocytotoxicity (IC50 = 157 nM) upon irradiation with near-infrared (NIR) light, and virtually no toxicity in the dark (IC50 = 117 μM). Photocytotoxicity was subsequently determined under hypoxic conditions. Additionally, a preliminarily pathway investigation of the mitochondrial membrane potential (MMP) disruption and induction of apoptosis by MLC31 was carried out. Our results underline how agent design involving both hydrophilic and lipophilic peripheral groups may serve as an effective way to improve the PDT efficiency of highly aromatic PSs for NIR light-mediated cancer therapy

Viral vector-mediated reprogramming of the fibroblastic tumor stroma sustains curative melanoma treatment.

The tumor microenvironment (TME) is a complex amalgam of tumor cells, immune cells, endothelial cells and fibroblastic stromal cells (FSC). Cancer-associated fibroblasts are generally seen as tumor-promoting entity. However, it is conceivable that particular FSC populations within the TME contribute to immune-mediated tumor control. Here, we show that intratumoral treatment of mice with a recombinant lymphocytic choriomeningitis virus-based vaccine vector expressing a melanocyte differentiation antigen resulted in T cell-dependent long-term control of melanomas. Using single-cell RNA-seq analysis, we demonstrate that viral vector-mediated transduction reprogrammed and activated a Cxcl13-expressing FSC subset that show a pronounced immunostimulatory signature and increased expression of the inflammatory cytokine IL-33. Ablation of Il33 gene expression in Cxcl13-Cre-positive FSCs reduces the functionality of intratumoral T cells and unleashes tumor growth. Thus, reprogramming of FSCs by a self-antigen-expressing viral vector in the TME is critical for curative melanoma treatment by locally sustaining the activity of tumor-specific T cells