Selection of Metarhizium spp. Brazilian isolates to control Rhipicephalus microplus ticks: in vitro virulence tests and conidiogenesis

This study aimed to select Metarhizium spp. isolates to control Rhipicephalus microplus ticks by analyzing their in vitro virulence against R. microplus eggs, larvae, and engorged females as well as their ability to produce aerial conidia on potato dextrose agar (PDA). After the treatment of R. microplus eggs with the highest fungal concentration (108 conidia.ml-1), most of the eleven tested isolates reduced the larval hatching compared to the control group, except M. anisopliae s.l. ARSEF 2211 and ARSEF 3641. M. anisopliae s.l. isolates ARSEF 729, ARSEF 760, ARSEF 929, and ARSEF 3643 exhibited the best results in the egg bioassay. In the bioassay with larvae, the entomopathogenic fungal isolates yielded average larval mortality ranging from 0.1% to 98.9% and from 23.9% to 99.9% five and fifteen days after the treatment, respectively. ARSEF 552, ARSEF 729, ARSEF 929, and ARSEF 3643 yielded the highest larval mortality. Analysis of the bioassay with R. microplus engorged females found that the different isolates negatively impacted the egg mass weight, larval hatching percent, egg production index, and nutritional index. The percent of tick control ranged from 5.32% to 70.83%, and the best tick control rates were caused by M. anisopliae s.l. ARSEF 3643 (70.83%), ARSEF 3641 (62.87%), and ARSEF 729 (64.27%). The highest conidiogenesis on PDA was observed for M. anisopliae s.l. ARSEF 3641 and M. pingshaense ARSEF 552. The isolates ARSEF 729 and ARSEF 3643 are considered promising candidates for field applications against R. microplus ticks

Parasitology Research

Texto completo: acesso restrito. p. 1473–1480Rhipicephalus microplus (Canestrini) is an ectoparasite accountable for great economic losses. The use of entomopathogenic fungi to control arthropods has shown promising responses. The present study evaluated the virulence of Isaria farinosa (Holmsk.) Fr., Isaria fumosorosea (Wize) Brown and Smith, and Purpureocillium lilacinum (=Paecilomyces lilacinus) (Thom.) Samson to engorged females, eggs, and larvae of R. microplus. There were four treatment groups (105, 106, 107, and 108 conidia ml−1) and the control group (water and Tween 80, 0.1 % v/v). The treatment was based on immersion of the specimen in 1 ml of the suspension or control solution. The study observed changes in egg viability and larval mortality after treatment. The results showed that I. farinosa, P. lilacinum, and I. fumosorosea caused alterations in the biological parameters of R. microplus ticks. I. fumosorosea presented the greatest potential to control R. microplus engorged females in vitro, causing a 49 % decrease in nutritional index. All fungal isolates presented significant reduction in the egg production index. I. farinosa reduced the hatching percentage if the eggs were treated with the two highest conidial concentrations. All conidial concentrations of I. fumosorosea were able to reduce the hatching percentage significantly. All tested isolates showed pathogenicity toward unfed R. microplus larvae. As far as we know, this is the first study reporting the effect in vitro of I. farinosa, I. fumosorosea, and P. lilacinum to different developmental stages of R. microplus ticks

PATOGENICIDADE IN VITRO DE Metarhizium anisopliae S.L. SOBRE LARVAS E NINFAS DE Ornithodoros mimon (ACARI: ARGASIDAE)

Ornithodoros mimon é um carrapato argasídeo comum a Chiroptera na região Neotropical, mas bastante agressivos aos humanos, pois a espécie é frequentemente encontrada em habitações humanas. Atualmente, não foram estabelecidos métodos de controle. Porém, trabalhos prévios já demonstraram a susceptibilidade de outros argasí- deos a fungos entomopatogênicos. Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo verificar a patogenicidade in vitro de Metarhizium anisopliae s.l. sobre larvas e ninfas de primeiro ínstar ingurgitadas e não ingurgitadas de O. mimon. O parâmetro avaliado foi o percentual de mortalidade das larvas e ninfas. Como resultados, observaram-se 80% de mortalidade do estágio larval na concentração de 107 conídios/mL e 91,4% para larvas submetidas à concentração de 108 conídios/mL. As ninfas ingurgitadas imersas na concentração 107 conídios/ mL foram mais susceptíveis ao fungo que as ninfas não ingurgitadas. Com relação à concentração 108 conídios/mL não foi observada diferença significativa, uma vez que se obteve um percentual médio de mortalidade acima de 95% tanto para as ninfas alimentadas como para as não alimentadas. Com base nos resultados obtidos, pode-se concluir que os estágios de O. mimon estudados são susceptíveis a M. anisopliae

Compatibilidade de Heterorhabditis amazonensis (Rhabditida: Heterorhabditidae) isolado RSC-5 com diferentes carrapaticidas utilizados no controle de Rhipicephalus microplus(Acari: Ixodidae)

O estudo teve como objetivo avaliar a viabilidade de Heterorhabditisamazonensis isolado RSC-5 após exposição a diferentes carrapaticidas utilizados no controle de Rhipicephalusmicroplus. Foram constituídos seis tratamentos, cada um composto por um produto, sendo cada grupo com 75.000 nematoides (NEPs) em suspensão de 20 mL de solução de diferentes carrapaticidas, em concentração comercial. O controle foi formado por 75.000 NEPs e 20 mL de água destilada, e todos os grupos foram mantidos em câmara climatizada a 25°C. A avaliação do percentual de sobrevivência e infectividade em lagartas Galleria mellonella foi realizada 24 e 72 horas após o início do experimento. A mortalidade de lagartas no teste de infectividade foi analisada após 72 e 120 horas. Com 24 horas de exposição, o percentual de sobrevivência de H. amazonensis RSC-5 não foi significativamente reduzido (p > 0,05) somente na exposição ao princípio ativo deltametrina. O mesmo foi observado no período de 72 horas em relação à associação clorpirifós + cipermetrina + butóxido de piperonila + citronelal. Não foi constatada sobrevivência de nenhum juvenil infectivo nos grupos expostos à associação clorfenvinfós + diclorvós. A exposição ao clorfenvinfós resultou em percentual de sobrevivência inferior a 50% após 72 horas. O potencial de infectar lagartas de G. mellonella foi reduzido apenas no grupo tratado com o princípio ativo clorfenvinfós. Dessa forma, é possível concluir que o princípio ativo clorfenvinfós e a associação clorfenvinfós + diclorvós não foram compatíveis com H. AmazonensesRSC-5, causando redução no percentual de sobrevivência e infectividade dos juvenis desse nematoide. Os outros produtos foram compatíveis, não causando redução na infectividade do isolado testado

EFICIÊNCIA in vitro DE UMA FORMULAÇÃO OLEOSA DE Metarhizium anisopliae SENSU LATO NO CONTROLE DE Rhipicephalus microplus

Rhipicephalus microplus é um ectoparasito responsável por grandes perdas econômicas na pecuária bovina. Na tentativa de diminuir o emprego de produtos químicos e os problemas por eles acarretados, a elaboração de formulações de entomopatógenos vem se destacando nas pesquisas de formas alternativas no combate deste carrapato. Assim o objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia de formulações oleosas de um produto comercial de M. anisopliae (Metarril WP Organic®) em diferentes concentrações de óleo mineral, sobre ovos, larvas e fêmeas ingurgitadas do carrapato R. microplus. Para realização deste estudo, foram formados oito grupos: um grupo controle aquoso, tratado apenas com água destilada estéril e Tween 80 a 0,1%; um grupo tratado com a suspensão aquosa de Metarril WP Organic®; três grupos controle contendo 1, 3 ou 5% de óleo mineral, e três grupos tratados com as formulações de Metarril WP Organic® contendo 1, 3 ou 5% de óleo mineral. As formulações possuíam a concentração de 108 conídios/mL. O tratamento consistiu na imersão dos espécimes em um ml da suspensão testada durante três minutos. Os parâmetros biológicos das fêmeas ingurgitadas foram significativamente alterados pelas formulações oleosas de Metarril WP Organic®, sendo observado um percentual de controle de 97,35% no grupo tratado com a formulação fúngica contendo 5% de óleo mineral. No tratamento de ovos, as formulações oleosas de Metarril WP Organic® reduziram em até 55 vezes a eclosão das larvas quando comparadas aos grupos controle. No tratamento de larvas, a mortalidade foi de 100% no quinto dia após o tratamento com as formulações fúngicas contendo 3 e 5% de óleo mineral. Estes resultados sugerem que as formulações de Metarril WP Organic® contendo 1, 3 ou 5% de óleo mineral são eficientes, in vitro, contra os está- gios de desenvolvimento do carrapato R. microplus

Estudo morfológico de isolados de Beauveria bassiana antes e após reisolamento em Rhipicephalus microplus

Beauveria bassiana é um fungo artropodopatogênico cosmopolita que possui o carrapato dos bovinos Rhipicephalus microplus como hospedeiro. Neste cenário, estudos morfológicos e de produtividade conidial em meio de cultura podem indicar isolados que possuam potencial para produção em larga escala. O presente trabalho avaliou a macromorfologia e micromorfologia, além da produção conidial de dez isolados de B. bassiana antes e após uma passagem (ciclo de desenvolvimento) sobre R. microplus. Macroscopicamente, variações de diâmetro, aparência, aspecto de colônia, exsudação e cor de reverso foram observadas após o reisolamento. Por outro lado, o processo não alterou parâmetros como desenvolvimento dos conidióforos, formato e tamanho de conídios. Em relação à produção conidial, seis isolados aumentaram significativamente o número de conídios contados por área. Como destaque, o isolado Bb 02, que possui o carrapato como hospedeiro original de isolamento, apresentou aumento da pulverulência e produção conidial após apenas uma única passagem. Assim, acredita-se que para avaliações futuras com cunho comercial, estudos que envolvam mais passagens em hospedeiros em potencial, bem como sua associação a análises de patogenicidade e atividade enzimática, podem expressar resultados mais relevantes para o controle biológico

Oil-based formulations containing arthropodpathogenic fungi to control Rhipicephalus microplus

ABSTRACT. Angelo I.C., Diniz-Neto H.C., Santos S.V., Perinotto W.M.S., Quinelato S., Santos H.A., Gôlo P.S., Camargo M.G., Marciano A.F. & Bittencourt V.R.E.P. [Oil-based formulations containing arthropodpathogenic fungi to control Rhipicephalus microplus.] Formulações oleosas contendo fungos artropodopatogênicos para o controle de Rhipicephalus microplus. Revista Brasileira de Medicina Veterinária, 37(Supl.1):18-24, 2015. Departamento de Epidemiologia e Saúde Pública, Universidade Federal Rural do Estado do Rio de Janeiro, BR 465, Km 7, Seropédica, RJ 23897-970, Brasil. E-mail: [email protected] Rhipicephalus microplus ticks are responsible for economical losses estimated in U$ 3.24 billions per year in Brazil. Arthropodpathogenic fungi are an important alternative to the chemical control of this arthropod; however to be efficient in the field, formulations must be developed to protect conidia against environmental stresses. The present study compared the efficacy of mineral or vegetal oil-based formulations containing Metarhizium anisopliae s.l. or Beauveria bassiana s.l. as well as their association to control R. microplus engorged females. M. anisopliae and B. bassiana isolates were cultivated in Potato Dextrose Agar medium and maintained under optimal conditions. Single fungus oil-based formulations were prepared with the following proportions: 84% aqueous fungal suspension; 15% sterile oil; 1% Tween 80. Associated fungal formulations were prepared as follows: 42% aqueous M. anisopliae suspension; 42% aqueous B. bassiana suspension; 15% sterile oil and 1% Tween. Engorged females were immersed in 1 mL oil formulations. The following biological parameters were evaluated: initial weigh of engorged female; weight of egg mass; egg production index; nutritional index and percentage of tick control. There was no difference in the percentage of tick control when M. anisopliae s.l. and/or B. bassiana s.l. were tested in mineral oil. Although, when vegetable oil-based formulations were tested, only M. anisopliae s.l. formulations (both single and associated) had satisfactory control percentage (41.97% and 40. 13%) while single fungus B. bassiana s.l. formulation yield a very low percentage of tick control (10.88%). Accordingly, the use of different oils (mineral or vegetable oils) may affect in different ways the arthropodpathogenic fungi efficacy to control R. microplus. Therefore, different oils should be tested in formulations to control ticks, as well as their interactions with different fungal isolates what will contribute to the development of a promising alternative to control this important parasite

Hemocytes quantification in Rhipicephalus microplus engorged females infected by Beauveria bassiana s.l.

ABSTRACT. Freitas M.C., Coutinho-Rodrigues C.J.B., Perinotto W.M.S., Nogueira M.R.S., Chagas T.T., Marciano A.F., Camargo M.G., Quinelato S., Gôlo P.S., Sá F.A. & Bittencourt V.R.E.P.[Hemocytes quantification in Rhipicephalus microplus engorged females infected by Beauveria bassiana s.l.] Quantifica- ção de hemócitos em fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus infectadas por Beauveria bassiana s.l. Revista Brasileira de Medicina Veterinária, 37(Supl.1):63- 70, 2015. Departamento de Parasitologia Animal, Instituto de Veterinária, Anexo 1, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Campus Seropédica, BR 465 Km 7, Seropédica, RJ 23897-970, Brasil. E-mail: [email protected] Rhipicephalus microplus tick is an ectoparasite with a great negative impact for veterinary medicine. Under massive infestations cattle may present severe anemia; besides that, ticks can transmit pathogenic agents causing host death. Among the methods used to alternatively control ticks is the use of the arthropodpathogenic fungus Beauveria bassiana s.l. that has been considered promising due to the fungus capacity of penetration of full cuticle in all tick developmental stages, colonizing them and causing tick death. Arthropod immune response is basically composed of humoral and cellular components. Several cell types that actively work against microbial infection are present within the hemolymph. The aim of the present study was to evaluate the amount and identify hemocytes present in the hemolymph of R. microplus engorged females artificially inoculated with B. bassiana senso latu (s.l.) conidia (isolate CG 206). Fungal suspension (1 × 108 conidia/mL) or Tween 0.01% (control group) were inoculated in R. microplus engorged females. Hemolymph collections were made through the female dorsal region (for quantitative analysis) and the distal section of the legs (for qualitative analysis) 24, 48 and 72 hours after fungal inoculation. Hemocytes quantification was performed using a Neubauer chamber. Qualitative analysis was carried out by a smear of hemolymph on slides. Data were submitted to Mann-Whitney test for comparison of averages on a significance level of 5% (p <0.05). Comparison between unexposed females and females exposed to B. bassiana s.l. showed that hemolymph from the fungus treated group presented significant reduced amount of hemocytes 24 hours after fungal inoculation. Total amount of hemocytes 48 hours after fungal inoculation was 49.5 times lower in comparison with the amount observed 24 after fungal exposure. The following hemocytes were identified in tick females’ hemolymph: prohemocytes, granulocytes, plasmatocytes, spherulocytes and possible oenocytoids. Based on these results, it is concluded that inoculation of B. bassiana s.l. isolate CG 206 caused cellular alteration in the hemolymph of R. microplus females showing reduction of total amount of hemocytes 48 hours after fungal inoculation

CONTROLE DE Dermacentor nitens UTILIZANDO UMA FORMULAÇÃO COMERCIAL A BASE DE Metarhizium anisopliae

Dermacentor nitens, carrapato encontrado comumente no conduto auditivo de equideos, é um ectoparasito que causa grandes perdas econô- micas devido aos danos diretos causados pelo seu parasitismo, transmissão de patógenos e embargos durante a comercialização e transporte de equinos. Metarhizium anisopliae é um fungo entomopatogê- nico cosmopolita, que vem sendo utilizado no controle in vitro de carrapatos. Com intuito de potencializar e viabilizar a utilização destes microrganismos in vivo, estudos tem demonstrado que quando formulados, os fungos entomopatogênicos alcançam melhores percentuais de controle sobre as pragas alvo. Isso tem despertado o interesse de indústrias que tem investido na formulação de fungos entomopatogênicos. Metarril WP® é um produto comercial a base de M. anisopliae, utilizado no controle de pragas agrícolas, porém existem poucos estudos sobre carrapatos. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de Metarril WP® sobre fê- meas parcialmente ingurgitadas, ovos e larvas de D. nitens. As formulações foram preparadas seguindo as recomendações do fabricante e ajustadas para 107 e 108 conídios/mL, acrescidas de 0,5 e 10% de óleo mineral. Como resultados pode se observar que os parâmetros biológicos: peso da postura, índice de produção de ovos e índice nutricional das fêmeas semi ingurgitadas, foram significativamente reduzidos pelas formulações oleosas a 10% com 107 e 108 conídios/mL, proporcionando percentuais de controle variando de 10,57 a 82,48%. Além disso, também demonstraram eficácia para ovos e larvas de D. nitens. Desta forma, pode se concluir que Metarril WP® formulado em óleo mineral foi eficaz no controle in vitro dos diferentes estágios de desenvolvimento de D. nitens. Este é o primeiro relato da eficácia deste produto comercial para esta espécie de carrapato