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Entwicklung und diagnostische Anwendung eines neuen Nachweisverfahrens zur Bestimmung und Charakterisierung von Autoantikörpern gegen den Insulin-like Growth Factor 1 Rezeptor
Autoantibodies (aAb) are characteristic for autoimmune diseases. Specific aAb
are often found both in diseased and apparently healthy individuals and may
precede pathological symptoms. The contribution of thyrotropin receptor (TSHR)
stimulating aAb to the progression of Graves´ Orbitopathy (GO) is widely
accepted. The coexistence of stimulating insulin-like growth factor 1 receptor
(IGF1R) aAb in GO patients was hypothesized and tested in the present study.
As no method for routine testing was available, a suitable non-radioactive
test was established to evaluate IGF1R-aAb in human sera and test the
hypothesis. As a first step, an IGF1R-aAb precipitation assay for detection
and reliable quantification of these aAb was developed. This work package
included the genetic engineering and expression of the recombinant antigen,
its purification and characterization, the definition of a standardized
operating procedure, and the adaptation of the assay format for future routine
use. Assay development also includes the generation and purification of
monoclonal antibodies (mAb) to the IGF1R, needed for standardization and
supplementary characterization of the assay. A central part of this work
focuses on the clinical, biological and molecular role of IGF1R aAb. To this
end, aAb were purified from human sera and characterized in vitro. The IGF1R-
aAb inhibit signal transduction via the IGF1R directly and acted as
antagonists of IGF1-induced proliferation of MCF7 breast cancer cells in
culture An analysis of IGF1R protein domains indicates that IGF1R aAb in human
sera are polyclonal and often recognize conformational epitopes. As IGF1R aAb
were detected with a prevalence of approx. 10% in human subjects, and
immunoglobulins are known to contain two antigen binding sites, a second more
direct and convenient assay type was developed for routine diagnostic use. A
cohort of GO patients were analyzed yielding a prevalence of 10% positive
IGF1R-aAb carriers, but not different from the prevalence in healthy controls.
Moreover, IGF1R-aAb were not stimulating the IGF1R. Hence, the initial
hypothesis that IGF1R-Ab contribute to GO pathogenesis needs to be rejected as
it was not supported by the data. Nevertheless, this study demonstrates a high
prevalence of aAb against the IGF1R in pathological samples and apparently
healthy subjects as well, which might be of clinical importance given the
central role of IGF1 in growth, metabolism and disease. In cooperation with a
fellow PhD student who established an analogous assay for the structurally-
related insulin receptor (IR), an analysis of the specificity of the IGF1R-aAb
was performed. We realized that roughly 50% of IGF1R-aAb positive samples
cross-reacted with the IR, highlighting their potential clinical importance
for a specific form of diabetes mellitus, i.e., autoimmune type B insulin
resistance. Further studies with samples from well characterized samples,
respective pre- and diabetic patients, and controls are needed to clarify this
notion. Collectively, two novel analytical assays for the identification and
quantification of IGF1R-aAb were successful established and characterized.
With these tools, the prominent hypothesis on the causal importance of
stimulating IGF1R-aAb for the development and course of GO was tested and
rejected. However, the high prevalence of IGF1R-aAb in diseased and healthy
donors, the antagonistic nature, and the cross-reactivity of these aAb to the
IR, indicate their potential relevance in certain forms of insulin resistance,
metabolism or growth deficiencies, which needs to be clarified in future
studies.Autoantikörper (aAb) sind charakteristisch für Autoimmunkrankheiten.
Spezifische aAb werden häufig in erkrankten, aber häufig auch in gesunden
Personen gefunden, wobei sie pathologischen Symptomen vorangehen oder diese
kausal begründen können. Die Beteiligung von stimulierenden Thyrotropin-
Rezeptor (TSHR) aAb im Krankheitsverlauf von Graves´ Orbitopathie (GO) ist
weitreichend anerkannt. Als Hypothese wurde auch von vielen Experten
akzeptiert, dass stimulierende aAb gegen den Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor
1 Rezeptor (IGF1R) in Patienten mit GO auftreten und diese aAb den
Exophthalmus verursachen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde diese Hypothese
experimentell überprüft. Da derzeit aber kein Verfahren für den routinemäßigen
Nachweis von IGF1R-aAb verfügbar ist, wurde ein geeignetes, nicht-radioaktives
Nachweisverfahren entwickelt, um IGF1R-aAb in humanen Seren von GO Patienten
und Kontrollen zu bestimmen und die aufgestellte Hypothese zu testen. Der
erste Teil der Arbeit umfasst die Entwicklung eines IGF1R-aAb
Präzipitationsassays für den Nachweis und die verlässliche Quantifizierung
dieser aAb. Hierfür musste eine genetische Herstellung und Expression des
rekombinanten Antigens, sowie dessen Aufreinigung und Charakterisierung
erfolgen. Abgeschlossen wurde dieses Arbeitspaket mit der Entwicklung und
Definition eines standardisierten Protokolls zur Darstellung dieser zentralen
Assaykomponente und die Adaptierung des Assayformats für eine routinemäßige
Anwendung. Die Entwicklung des Nachweisverfahrens beinhaltete zudem die
Generierung und Aufreinigung monoklonaler Antikörper (mAb) zum Antigen IGF1R,
die für eine Standardisierung und die erweiterte Charakterisierung des Assays
erforderlich sind. Der zweite und zentrale Teil dieser Arbeit beinhaltet die
Charakterisierung der klinischen, biologischen und molekularen Bedeutung der
IGF1R-aAb. Hierfür wurden aAb aus humanen Seren isoliert und in vitro
charakterisiert. Es wurde eine direkte Inhibierung der Signaltransduktion über
den IGF1R durch die IGF1R-aAb nachgewiesen. Zusätzlich konnte die direkte
Wirkung von IGF1R-aAb als Antagonisten zur IGF1-induzierten Zellproliferation
von MCF7 Brustkrebszellen in der Zellkultur gezeigt werden. Zur weiteren
Charakterisierung wurde eine Feinanalyse mit rekombinanten Proteindomänen des
IGF1R durchgeführt. Es zeigte sich, dass die IGF1R-aAb in humanen Seren
polyklonal vorliegen und auch Konformationsepitope des Antigens erkennen. Da
IGF1R-aAb mit einer Prävalenz von ca. 10% in humanen Testpersonen vorkommen
und bekannt ist, dass Immunoglobuline zwei Antigen-Bindestellen besitzen,
sollte zusätzlich ein weiteres Assaysystem für die routinemäßige und
schnellere Diagnostikanwendung entwickelt werden. Der entwickelte IGF1R-aAb
Präzipitationsassay wurde als Methode zur Bestimmung von IGF1R-aAb in einer
Kohorte pathologischer GO Patienten angewendet. Es wurde wiederum eine
Prävalenz von 10% positiver IGF1R-aAb Träger nachgewiesen, welche sich somit
nicht von der Prävalenz bei gesunden Menschen unterschied. Des Weiteren wurde
festgestellt, dass diese IGF1R-aAb nicht stimulierend sondern antagonisierend
auf den IGF1R wirken. Die Hypothese, dass IGF1R-aAb entscheidend zur
Pathogenese von GO beitragen, wird somit von diesen Ergebnissen nicht gestützt
und muss dementsprechend verworfen werden. Gleichwohl wurde in weiteren
Vermessungen die relativ hohe Prävalenz von aAb gegen den IGF1R bestätigt, was
hinsichtlich der zentralen Rolle von IGF1 für Wachstum, Metabolismus und
Onkologie auf eine potentiell bedeutende klinische Relevanz der IGF1R-aAb
hindeutet. In Kooperation mit einem Kollegen, der ein analog funktionierendes
Nachweissystem für den strukturell ähnlichen Insulinrezeptor (IR) etabliert
hatte, gelang ein detaillierter Vergleich der Kreuzreaktivität dieser aAb und
die Identifizierung immunopositiver Probanden mit sowohl IGF1R- als auch IR-
aAb. Hierbei konnten wir eine Kreuzreaktion bei ca. 50% der positiven Seren
feststellen. Für eine grundlegende Einordnung dieser Ergebnisse und der
pathologischen Relevanz der aAb ist die Vermessung weiterer Humanstudien mit
Proben gut charakterisierter Probanden notwendig. Im Rahmen dieser Arbeit
wurden somit zwei neue analytische Nachweisverfahren zur Identifizierung und
Quantifizierung von IGF1R-aAb entwickelt, etabliert und charakterisiert. Die
weit verbreitete Annahme, dass stimulierende IGF1R-aAb als Mitursache von
Graves´ Orbitopathie angesehen werden müssen, konnte in dieser Arbeit
widerlegt werden. Die festgestellte relativ hohe Prävalenz von IGF1R-aAb in
Patienten und scheinbar gesunden Kontrollprobanden, deren antagonistische
Wirkung am IGF1R, und die Kreuzreaktivität zum IR, sprechen für eine
pathophysiologische Relevanz der IGF1R-aAb in der klinischen Diagnostik. Die
in dieser Arbeit neu etablierten Assays können in Zukunft geeignet sein, um
eine bessere Einordnung und Diagnostik bestimmter Formen von Insulinresistenz,
sowie Wachstums- und Stoffwechselstörungen vorzunehmen. Gegebenenfalls werden
sie sich auch als sinnvolle Methode bei stratifizierenden Verfahren in der
Therapie erweisen
Antagonistic Autoantibodies to Insulin-Like Growth Factor-1 Receptor Associate with Poor Physical Strength
Natural autoantibodies to the IGF1 receptor (IGF1R-aAb) have been described in relation to Graves' ophthalmopathy. Other physiological roles of natural IGF1R-aAb are not known. We hypothesized that IGF1R-aAb may be related to muscle development. Serum samples (n = 408) from young overweight subjects (n = 143) were collected during a lifestyle intervention study. Anthropometric parameters, along with leptin, IGF1 and IGF1R-aAb concentrations, were analyzed, and the subjects were categorized into positive or negative for IGF1R-aAb. Eleven out of 143 subjects (7.7%) were positive for IGF1R-aAb. Identified IGF1R-aAb were molecularly characterized and showed antagonistic activity in vitro impairing IGF1-mediated IGF1R activation. Mean body weight, height or age were similar between IGF1R-aAb-positive and -negative subjects, but IGF1 concentrations differed. Jumping ability, as well as right and left handgrip strengths, were lower in the IGF1R-aAb-positive as compared to the IGF1R-aAb-negative subjects. We conclude that natural IGF1R-aAb are detectable in apparently healthy subjects and are capable of antagonizing IGF1-dependent IGF1R activation. Moreover, the presence of IGF1R-aAb is associated with poor physical strength. Although the causality of this association is unclear, the data imply a potential influence of IGF1R autoimmunity on muscle development