Investigations concerning functional leukocyte inhibtion in cardiac surgery patients undergoing extracorporeal circulation

Operative Eingriffe am offenen Herzen wie die häufig durchgeführten Bypass- und Herzklappenersatzoperationen bedürfen fast immer der Unterstützung durch die Herz Lungenmaschine bzw. extrakorporale Zirkulation. Durch den Kontakt des Blutes mit nichtorganischen Fremdoberflächen der EKZ kommt es zur Induktion einer transienten Hyperaktivität neutrophiler Granulozyten. Nachdem Herz und Lunge nach Öffnung der Aortenklemme ihre physiologische Funktion wieder aufnehmen und reperfundiert werden, werden aus diesen ischämischen Organen darüber hinaus pathogene Moleküle wie freie Sauerstoffradikale freigesetzt. Von aktivierten Neutrophilen freigesetzte, immmunkompetente Moleküle (z.B. Zytokine) führen zusammen mit diesem oxidativen Stress zu Organdysfunktionen durch Ödembildung in Körpergeweben wie Myokard, Lunge, Gehirn und Gastrointestinaltrakt und dadurch zu typischen Folgeerscheinungen wie z.B. verlängerter postoperativer Beatmungszeit oder (meist transienten) neuropsychologischen Dysfunktionen im Sinne von kognitiven Defiziten. Andere Pathomechanismen wie Mikroembolien durch z.B. Kleinstteilchen und Gasbildungen aus dem OP Gebiet verstärken diese pathogenen Effekte. Resultat ist eine verlängerte Regenerationsdauer und ein verlängerter Krankenhausaufenthalt der operierten Patienten. Zur Minimierung dieser unerwünschten Wirkungen der EKZ wurden in den letzen 20 Jahren diverse Techniken zur Filtration der unterschiedlichen Kreislaufbestandteile innerhalb der EKZ entwickelt. Von besonderem Interesse ist die seit ca. 8 bis 10 Jahren etablierte Filtration aktivierter neutrophiler Granulozyten, die die Hauptverantwortung für das aseptische Entzündungsgeschehen unter Anwendung der EKZ tragen. Entwicklung und Einsatz dieser leukozytenspezifischen Filtersysteme führt zwar zu einer deutlichen Reduktion der zirkulierenden immunaktiven Zellen und zu einer geringgradigen Verringerung der pathogenen EKZ Folgeerscheinungen, die Effektivität der gegenwärtigen Leukozytenfiltration stellt sich allerdings nur in einzelnen Berichten als positiv dar. Die Daten, die einen deutlichen klinischen Vorteil der Leukozytenfiltration zeigen, sind nicht vorhanden. Die unterstützende Anwendung antiinflammatorischer, systemisch angewandter Pharmaka führte zwar bei den meisten Präparaten zu Erfolg versprechenden Ergebnissen im Tierversuch, konnte aber beim operierten Patienten selbst zu keiner deutlichen Verminderung der unerwünschten EKZ Wirkungen beitragen. Unter der Vorstellung, dass gefilterte, aktivierte Leukozyten zum Großteil zwar nicht in den Patientenkreislauf zurückgepumpt werden, jedoch immer noch immunaktive Stoffe von ihnen synthetisiert und sezerniert werden können, liegt es auf der Hand, dass die aktuell zum klinischen Einsatz kommenden Filtersysteme zum Zwecke der Filtrationsoptimierung und konsekutiver Pathogenitätsminimierung durchaus verbesserungsbedürftig sind. Die in Abschnitt 3 angeführten Ergebnisse belegen, dass antikörperbeschichtete Leukozytenfiltermembranen durchaus in der Lage sind, in einem Kreislaufmodell ihre entsprechenden Antigene herauszufiltern und damit zu inaktivieren. Als klinische Anwendung ist dieses Modell allerdings nur unter einem immensem Technik- sowie Kostenaufwand umsetzbar, so dass sich die Frage nach alternativen Lösungsstrategien stellt. Diese Arbeit leistete die theoretische Grundlage zur Entwicklung eines in naher Zukunft möglicherweise klinisch praktikablen Moduls zur Leukozyteninaktivierung. Da anti CD95 IgM in der Lage sind, Apoptose in CD95 Rezeptor tragenden Zellen zu induzieren und diese damit bzgl. ihrer Stoffwechselaktivität zu limitieren bzw. zu inaktivieren, konnte ein ebenfalls in Abschnitt 3 vorgestelltes Modell zeigen, dass in CD 95 Rezeptor tragenden Zellen über ihren Kontakt mit anti CD95 IgM beschichteten Leukozytenfiltermembranen Apoptose induziert werden kann. Ein detailverbessertes, anti CD95 IgM beschichtetes Leukozytenfiltersystem (Leukozyteninhibitionsmodul, „LIM“) zeigte bereits im Schweineversuch eine deutliche Verbesserung der postoperativen Herzfunktion gegenüber der Tiergruppe, die mit herkömmlichem Leukozytenfiltersystem operiert wurde. Außerdem konnte eine deutlich reduzierte Transmigrationsfähigkeit (als Maß des Aktivierungszustandes) der aus dieser EKZ isolierten Neutrophilen nachgewiesen werden, so dass Grund zur Annahme besteht, dass dieses Modell in Zukunft den herkömmlichen Leukozytenfilter ablösen könnte. Mit dieser Arbeit wurde eine Möglichkeit aufgezeigt, wie die Problematik der EKZ induzierten Immunpathogenese grundlegender bekämpft werden kann.Cardiovascular surgery like coronary bypass grafts or valvular tranplantation is often associated with the support by extracorporeal circulation (ECC). As a consequence of the contact between blood an anorganic surfaces an autoimmune reaction with chemotactical activation of neutrophil granulocytes and generation of immune cascades, e.g complement sytem, is started. After opening the Aortic cross clamp, ischemic heart and lung are perfused again, resume their physiological functions and release pathogenic molecules like free oxygen radicals, which aggravate the marring processes. Neutrophiles release immune modulation molecules like cytokines supported by free oxygen radicals mentioned above, which results in multiple organ dysfunctions like oedema in different tissues: myocard, lung, brain and gastrointestinal tract. This involves extended postoperative tracheal respiration and neuropsychological deficits like (often transient) cognitive deficits. Other pathomechanisms like small particles- and gas microemboli released from the operation area contribute to the pathogenic effects. As a result of this regeneration time and postoperative hospital residence are extended. To minimize these undesirable side effects caused by extarcorporeal circulation different strategies like filtration of the different ECC parts were developed within the last 20 years. Since 8-10 years filtration of activated neutrophiles, which are mainly responsible for the aseptic inflammation, was expected to be the most beneficial tool concerning this problem. On the one hand progression and use of these specific filter systems contribute to an effective quantitative reduction of activated neutrophiles inside of ECC and a marginal diminishment of pathogenic ECC consequences. On the other hand convincing scientific data regarding clinical benefit by leucocyte filtration systems is missing. The use of antiinflammatory systemical drugs showed promising results in animal experiments in contrast to the findings in cardiac surgery patients. Under the assumption, that on the one hand filtered, activated leucocytes are held by the filter meshes and not brought back into the patient circulation, on the other hand still produce and release immune modulation molecules it is obvious that these conventional leuycocyte filtration systems are not effective enough concerning their disposal and have to be improved within the next years. The results mentioned in part three proof, that antibody coated leucocyte filter membranes are able to filter and inactivate their respective antigenes in a circulation model. As a clinical application this model is indeed connected with an enormous complexity and expense. This doctorate performed the theoretical fundament for the development of a leukocyte inhibition module, which potentially can be applied for clinical use in the near future. Since anti CD95 IgM molecules are able to induce apoptosis in CD95 receptor positive cells and limit respectively inactivate these cells concerning their metabolism activity an also in part three introduced model indicated, that anti CD95 coated leukocyte filter membrane is able to induce apoptosis in CD95 receptor positive cells by contacting them. An advanced anti CD95 IgM coated model (leukocyte inhibition module, „LIM”) revealed an obvious improved postoperative heart function in a pork model compared to pork, which were operated with common leukocyte filter sytems. In addition to this, a definit reduced ability of transmigration (quantum of the cell activation status) was demonstrated for the neutrophiles isolated from ECC. In conclusion, LIM proved to be an effective tool to functionally inhibit leukocyte activation and thus to limit pathogenic sequelae related to cardiac surgery with ECC. LIM allows the inactivation of neutrophils via CD95 stimulation without affecting other organs by apoptosis-mediated inflammation. Further studies ought to be conducted to evaluate postoperative benefits and the efficacy of LIM in clinical studies

Targeted Delivery of Surface Modified Nanoparticles: Modulation of Inflammation for Acute Lung Injury

The objective of the study is to demonstrate alleviation of pulmonary inflammation associated with acute lung injury (ALI) using novel surface modified nanoparticles. ALI is characterized by three main pathological events: I) pulmonary edema, II) excessive pro-inflammatory cytokines and chemokines production from alveolar epithelial and endothelial cells and III) leukocyte migration from blood circulation into alveoli. Currently, there is no FDA approved pharmacological treatment available except the supportive mechanical ventilation therapy. Numerous clinical trials involving pharmacological therapies aimed at different pathological targets turned unsuccessful. National Institute of Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) cited underappreciation of drug delivery systems as one of the attributed drawbacks. During ALI, the αvβ6/αvβ5 integrins of alveolar epithelium and endothelium, respectively play a critical role in mediating pulmonary edema in interleukin-1b (IL-1b) stimulated ALI models. A transient blockade of both integrins by antibodies (Ab) or small Arg-Gly-Asp (RGD) peptide sequences may provide new causal therapies for pulmonary edema. A transcription factor, nuclear factor-kB (NF-kB) is associated with the regulation of a battery of genes that encode for pro-inflammatory cytokines, chemokines and cell adhesion molecules (CAMs). Glucocorticoids (GCs) exert their anti-inflammatory effects by NF-kB transcriptional interference mechanisms. Besides the above inflammatory mechanisms, leukocyte migration is another hallmark feature responsible for part of ALI pathogenesis. Leukocyte migration is dictated by sequential activation of adhesion molecules and their ligands on both leukocytes and endothelial cells (ECs). Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) located on alveolar endothelium plays a significant role in the recruitment of leukocytes into alveoli. Blockade of ICAM-1 receptors using anti-ICAM-1 antibodies may impede leukocyte migration into alveoli. In view of high mortality associated with ALI, there is an urgent need for a drug delivery system that inhibits majority of pathological events. In drug targeting research, liposomes are considered as versatile for their ability to carry drug payloads and flexible enough to modulate their surface for targeting purposes. In the current investigation, I developed surface modified stable liposome formulation for delivery of methylprednisolone succinate (a glucocorticoid; MPS) to the lung. Liposomes were targeted to the disease sites through different routes of administration to avail the spatial expression of the receptors in response to IL-1b stimulus. MPS-LcRGD targeted to avb6 integrins of alveolar epithelium attenuated pulmonary edema. MPS-LAb were able to modulate neutrophil migration. Moreover, MPS released from targeted liposomes inhibited the expression of pro-inflammatory cytokines and chemokines. The research work demonstrated the concept of using drug encapsulated and surface modified nanoparticles for therapeutic intervention of ALI