The Role of Androgens in Ovarian Follicular Development: From Fertility to Ovarian Cancer

Androgens, steroid hormones produced by follicular cells, play a crucial role in the regulation of ovarian function. They affect folliculogenesis directly through androgen receptors (ARs) or indirectly through aromatization to estrogens. Androgens are thought to be primarily involved in preantral follicle growth and prevention of follicular atresia. It also seems possible that they are involved in the activation of primordial follicles. According to the World Health Organization, endocrine-disrupting chemicals (EDCs) are substances that alter hormonal signaling. EDCs comprise a wide variety of synthetic or natural chemicals arising from anthropogenic, industrial, agricultural, and domestic sources. EDCs interfere with natural regulation of the endocrine system by either mimicking or blocking the function of endogenous hormones as well as acting directly on gene expression or through epigenetic modifications. Disruptions in ovarian processes caused by EDCs may originate adverse outcomes such as anovulation, infertility, or premature ovarian failure. In this chapter, we aim to point out a possible involvement of androgen excess or deficiency in the regulation of ovarian function. We will summarize the effects of EDCs expressing antiandrogenic or androgenic activity on female physiology. Continuous exposition to even small concentration of such compounds can initiate oncogenesis within the ovary

Domniemane komórki macierzyste izolowane z jajnika niedojrzałej płciowo świni : ich charakterystyka oraz ocena możliwości transformacji nowotworowej

Jajnik ssaków jest parzystym gruczołem rozrodczym umiejscowionym wewnątrz jamy otrzewnej. Ze względu na morfologię i funkcję składa się z dwóch głównych stref: kory i rdzenia. Kora zbudowana jest z tkanki łącznej, w której znajdują się pęcherzyki jajnikowe w różnych stadiach rozwojowych. Jest też źródłem różnych populacji dorosłych komórek macierzystych (ASCs). Domniemane komórki macierzyste (PSCs) to heterogenna populacja drobnych i okrągłych ASCs z jądrem wypełniającym prawie całą komórkę. PSCs zostały wyizolowane immunomagnetycznie względem epitopów SSEA-4 i CD34 z kory jajnika trawionej enzymatycznie. Jednak w toku badań, ze względu na profil ekspresji markerów typowych dla komórek macierzystych wybrano PSCs izolowane wyłącznie względem epitopu SSEA-4. Charakterystyka fenotypowa uzyskanych komórek PSC SSEA-4+ wykazała, ekspresję markerów multipotencjalnych, mezenchymalnych komórek macierzystych (MSCs) przy braku specyficznej ekspresji kluczowych markerów pluripotencji. Ponadto w hodowli in vitro PSCs SSEA-4+ tworzyły typowe dla komórek macierzystych skupiska przypominające ciała embrioidalne. PSCs SSEA-4+ różnicowały się w komórki układu nerwowego pod wpływem związków takich jak forskolina, kwas retinowy i bFGF. Ekspresja nestyny i NeuN świadczy o zróżnicowaniu PSCs SSEA-4+ w komórki podobne do neuronów, a ekspresja GFAP dowodzi, że niektóre z nich zróżnicowały się również w glej. Dodatkowo analiza aktywności kanałów jonowych patch clamp potwierdziła, że w wyniku różnicowania otrzymano komórki, które elektrofizjologicznie zachowują się jak neurony. PSCs SSEA-4+ różnicowano także w śródbłonek naczyń przy pomocy czynników wzrostu m. in. bFGF, VEGF, R3-IGF-1 oraz hEGF. Analizy charakterystycznych dla śródbłonka naczyń markerów takich jak VE-kadheryna i VEGFR dowodzą, że uzyskane komórki rzeczywiście są komórkami śródbłonka. Potwierdzają to również testy funkcjonowania komórek. Zarówno w teście migracji jak i teście tworzenia naczyń uzyskano pozytywne wyniki. Steroidy anaboliczne są wciąż powszechnie stosowane w masowej hodowli zwierząt gospodarskich oraz nielegalnie stosowane tak przez sportowców, jak i amatorów, pomimo, że są uznawane za związki potencjalnie rakotwórcze. W niniejszej pracy badano wpływ wybranych steroidów anabolicznych (boldenon i nandrolon) na PSCs SSEA-4+. Boldenon i nandrolon mają silne działanie anaboliczne oraz słabe działanie androgenowe prawdopodobnie przez receptor androgenowy (AR). Dodatkowo nandrolon jest silnym progestagenem, przez co jeszcze silniej może zaburzać funkcjonowanie żeńskiego układu rozrodczego. PSCs SSEA-4+ hodowano in vitro w obecności obu steroidów oddzielnie przez 7 i 14 dni. Zarówno po 7 jak i 14 dniach oba związki indukowały podwyższoną ekspresję białek CD44 i CD133, których nadekspresja jest charakterystyczna dla macierzystych komórek nowotworowych (CSC) oraz nowotworów jajnika. Izolowane immunomagnetycznie PSCs SSEA-4+ mają charakter multipotencjalnych MSCs. Z powodzeniem mogą być różnicowane w różne komórki układu nerwowego oraz w komórki śródbłonka naczyń. Dodatkowo są podatne na działanie innych związków endokrynnie czynnych w tym steroidów anabolicznych, które mogą potencjalnie kierować PSCs SSEA-4+ na drogę kancerogenezy.Mammalian ovaries are the twin reproductive glands located inside the peritoneal cavity. According to morphology and function, the ovaries consists of two main zones: the cortex and the core. The ovarian cortex is made up of connective tissue with follicles at various stages of development. It is also a source of different adult stem cell (ASCs) populations. Putative stem cells (PSCs) are a heterogeneous population of tiny and round ASCs with a nucleus that fills almost the entire cell. PSCs were immunomagnetically isolated due to the presence of SSEA-4 and CD34 epitopes from the ovarian cortex which was enzymatically digested. Based on the expression of stem cells (SCs) markers, for further experiments we chose PSCs isolated only for the presence of the SSEA-4 epitope. Characterization of the PSCs SSEA-4+ phenotype revealed the expression of multipotent, mesenchymal stem cell (MSCs) markers. In contrast, PSCs SSEA-4+ do not show specific expression of key pluripotency markers. In addition, PSCs SSEA-4+ cultured in vitro formed aggregates which are similar to embryonic bodies typical of SCs. PSCs SSEA-4+ differentiated into cells of the nervous system with compounds such as forskolin, retinoic acid and bFGF. Expression of nestin and NeuN indicates the differentiation of PSCs SSEA-4+ into neuron-like cells, whereas expression of GFAP proves that part of the PSCs SSEA-4+ also differentiated into glial cells. Moreover analysis of the activity of ionic channels by the patch clamp method confirmed that as a result of differentiation, cells that electrophysiologically behave like neurons were obtained. PSCs SSEA-4+ were also differentiated into the vascular endothelium using growth factors such as bFGF, VEGF, R3-IGF-1 and hEGF. Analysis of characteristic endothelial markers such as VE-cadherin and VEGFR shows that the cells obtained are indeed endothelial cells. This is also confirmed by cell functioning tests. In both the migration test and the vascular test, positive results were obtained. Anabolic steroids are still widely used in the industrial livestock breeding and illegally used, both by athletes and amateurs, although they are considered to be potentially carcinogenic. This work investigated the effect of selected anabolic steroids (boldenone and nandrolone) on PSCs SSEA-4+. Boldenone and nandrolone are probably to have a strong anabolic effect and weak androgenic effects via the androgen receptor (AR). In addition, nandrolone is a strong progestogen, which may even more actively affect the functioning of the female reproductive system. PSCs SSEA-4+ were cultured in vitro in the presence of both steroids separately for 7 and 14 days. After that time both compounds contributed to the increased expression of CD44 and CD133 proteins, whose overexpression is characteristic of cancer stem cells (CSCs) and ovarian tumors. Immunomagnetically isolated PSCs SSEA-4+ are multipotent MSCs. They can be successfully differentiated into various cells of the nervous system and endothelial cells. Moreover PSC SSEA-4+ are susceptible to other endocrine compounds, including anabolic steroids, which may potentially direct PSC SSEA-4+ into carcinogenesis

Stem cells of ovary.

Celem niniejszej pracy jest ogólna charakterystyka komórek macierzystych.Przedstawiono w niej sposoby klasyfikacji i obszary występowania tych niezwykłychkomórek zgodne ze stanem współczesnej wiedzy. Zilustrowano sposób, w jaki się dzieląi różnicują do innych typów komórek. Wspomniano również o konsekwencjach etycznych,jakie niosą za sobą badania, szczególnie nad embrionalnymi komórkami macierzystymi.W pracy skupiono się głównie na macierzystych komórkach serca, macicy i jajnika. Towłaśnie w nich upatruje się źródła nowych metod leczenia. W przypadku serca zwróconoszczególną uwagę na metody izolacji i ewentualne zastosowanie kardiomiocytówmacierzystych we współczesnej medycynie. Ukazano zdolność komórek macierzystychmacicy do indukcji w inne typy komórek. Na końcu zreferowano wyniki badań nadidentyfikacją genów markerowych dla komórek macierzystych jajnika. Mimo, iżzastosowanie komórek macierzystych, zwłaszcza wykorzystanie ich w medycynie, to bezwątpienia ogromna korzyść, nie brakuje wielu kontrowersji, wynikających głównie z etycznejstrony dotyczącej ich stosowania. Dlatego konieczne jest prowadzenie badań, mających nacelu uzyskiwanie komórek macierzystych w sposób, zgodny z etycznymi poglądami na tematludzkiego życia.The aim of this study is the general characteristics of the stem cells together with theclassification and localization of these unusual cells, consistently with contemporaryknowledge. In this manuscript it was tried to illustrate how the stem cells divide anddifferentiate into other cell types. Furthermore, it was mentioned about ethical consequenceswhich are the part of researches, particularly above all the germ stem cells. This studyconcentrated mainly on stem cells isolated from the heart, the uterus and the ovary. Exactly inthis cells we are tracking the source of new medical methods of treatment because of theirunique regenerative abilities. In case of the cardiac stem cells it was paid special attention tomethods of its isolation and possible application for treating heart diseases in the cell-basedtherapies. It was also demonstrated that the uterus stem cells have an extensive ability toinduction into other types of cells. However, much work remains to be done in the laboratoryand the clinic to understand how to use these cells for regenerative medicine. At the endfindings were reported about the identification of marker genes for stem cells isolated frommature ovary. In summary, stem cell research is one of the most fascinating areas ofcontemporary biology, but, as with many expanding fields of scientific inquiry, research onstem cells raises scientific and ethic questions as rapidly as it generates new discoveries

Non-genomic mechanism of antiandrogens action in porcine ovarian follicles

Celem pracy była identyfikacja pozagenomowego szlaku przekazywania sygnału w komórkach ziarnistych izolowanych z pęcherzyków jajnikowych świń, hodowanych wstępnie 24 godziny. Na ostatnie 5, 15, 30 i 60 minut hodowli, do medium hodowlanego dodawano odpowiednio testosteron (T, 1×10-7M), 2-hydroksyflutamid (2-Hf, 1,5×10-4M), vinclozolinę (Vnz, 1,4×10-5M), testosteron w obecności 2-hydroksyflutamidu (T+2-Hf) oraz testosteron w obecności vinclozoliny (T+Vnz). Z komórek wyizolowano białko całkowite, które badano pod kątem ekspresji kinaz Erk 1/2 i Akt oraz ich form ufosforylowanych. Przeprowadzono również badanie aktywności wymienionych kinaz metodą ELISA. Analizowane kinazy białkowe są składnikami wewnątrzkomórkowych szlaków sygnalizacyjnych. Stwierdzono, że krótko po dodaniu badanych czynników następuje wzrost zarówno ekspresji jak aktywności kinaz. Jest to szczególnie widoczne w grupach eksperymentalnych, w których stosowano antyandrogeny w obecności egzogennego testosteronu. Zjawisko to można tłumaczyć włączeniem pozagenomowego szlaku przekazywania sygnału, właśnie pod wpływem podawanych antyandrogenów. Zarówno 2-hydroksyflutamid jak i vinclozolinę zalicza się do niesteroidowych antagonistów receptora AR. Pierwszy z nich jest lekiem stosowanym w leczeniu hormonalnozależnego nowotworu prostaty i jajników. Drugi, to fungicyd stosowany powszechnie w rolnictwie. Otrzymane wyniki świadczą o tym, że Vnz zaburza prawidłowe działanie układu rozrodczego, prawdopodobnie indukując śmierć komórek ziarnistych pęcherzyka jajnikowego.The aim of this study was to investigate whether the androgen: testosterone (T) and the antiandrogens: 2-hydroxyflutamide (2-Hf) and vinclozolin (Vnz), influence cell signal transduction pathways in cultured (24 hours) granulosa cells isolated form porcine ovarian follicles. After that, T (1×10-7M), 2-Hf (1,5×10-4M), Vnz (1,4×10-5M) or both T+2-Hf and T+Vnz were added to the culture media. After increasing time of cell incubation (1, 5, 15, 30 and 60 min) the culture medium was removed and cells were lysed. Thirty micrograms of protein from each treatment group were examined by Western blot analysis to reveal the influence of antiandrogens on both, ERK1/2 and Akt kinases protein expression. Moreover, kinases activity were investigated by ELISA.The addition of as 2-Hf as Vnz to the culture media of granulosa cells increased phosphorylation and activity of ERK1/2 and Akt kinases. These results suggest that normal function of the ovary may be destroyed by the antiandrogens. They can activate the nongenomic signaling pathway used by androgens or act through the AR. This mechanism of action disturbs the physiological process of programmed cell death. It seems that selective destruction of porcine follicles is a serious consequence of their exposure to especially vinclozolin, leading to premature ovarian failure in the affected organism

The molecular quality and mitochondrial activity of porcine cumulus-oocyte complexes are affected by their exposure to three endocrine-active compounds under 3D in vitro maturation conditions

Thus far, the potential short- and long-term detrimental effects of a variety of environmental chemicals designated as endocrine-active compounds (EACs) have been found to interfere with histo- and anatomo-physiological functions of the reproductive system in humans and wildlife species. For those reasons, this study sought to examine whether selected EACs, which encompass the fungicide vinclozolin (Vnz), the androgenic anabolic steroid nandrolone (Ndn) and the immunosuppressant cyclosporin A (CsA), affect the developmental competence and molecular quality (MQ) of porcine cumulus–oocyte complexes (COCs) subjected to in vitro maturation (IVM) under 3D culture conditions. The COCs underwent 3D-IVM in the presence of Vnz, Ndn or CsA for 48 h. To explore whether the selected EACs induce internucleosomal DNA fragmentation in cumulus cells (CCs), TUNEL-assisted detection of late apoptotic cells was performed. Additionally, for the detailed evaluation of pro- and antiapoptotic pathways in COCs, apoptosis proteome profiler arrays were used. To determine changes in intracellular metabolism in COCs, comprehensive assessments of mitochondrial ultrastructure and activity were carried out. Moreover, the relative abundances (RAs) of mRNAs transcribed from genes that are involved in scavenging reactive oxygen species (ROS), such as SIRT3 and FOXO3, and intramitochondrial bioenergetic balance, such as ATP synthase subunit (ATP5A1), were ascertained. Finally, to investigate the extent of progression of oocyte maturation, the intraooplasmic levels of cAMP and the RAs of mRNA transcripts encoding regulatory and biocatalytic subunits of a heterodimeric meiosis-promoting factor, termed cyclin B1 (CCNB1) and cyclin-dependent kinase 1 (CDC2), were also estimated. The obtained results provide, for the first time, strong evidence that both Vnz and Ndn decrease the developmental competence of oocytes and stimulate apoptosis processes in CCs. The present study is also the first to highlight that Vnz accelerates the maturation process in immature oocytes due to both increased ROS production and the augmented RA of the CCNB1 gene. Furthermore, Vnz was proven to trigger proapoptotic events in CCs by prompting the activity of the FOXO3 transcription factor, which regulates the mitochondrial apoptosis pathway. In turn, Ndn was shown to inhibit oocyte maturation by inducing molecular events that ultimately lead to an increase in the intraooplasmic cAMP concentration. However, due to the simultaneous enhancement of the expression of TNF-β and HSP27 proteins in CCs, Ndn might be responsible for the onset of their neoplastic transformation. Finally, our current investigation is the first to clearly demonstrate that although CsA did not interfere with the nuclear and cytoplasmic maturation of oocytes, by inducing mitophagy in CCs, it disrupted oocyte metabolism, consequently attenuating the parameters related to the MQ of COCs. Summing up, Vnz, Ndn and CsA reduced not only the processes of growth and IVM but also the MQ of porcine COCs, which might make them unsuitable for assisted reproductive technologies (ARTs) such as in vitro fertilization by either gamete co-incubation or intracytoplasmic sperm injection (ICSI) and cloning by somatic cell nuclear transfer (SCNT)