Optimization of culture conditions of Beauveria bassiana and Mycoleptodiscus indicus aiming the production of metabolites with antimicrobial, antitumor and antiparasitic activity

Sabe-se que micro-organismos são vistos como promissoras fontes de moléculas bioativas, incluindo-se nesse grupo fungos endofíticos e também entomopatogênicos. Desse modo, foram selecionados o fungo entompatogênico Beauveria bassiana e o fungo endofítico Mycoleptodiscus indicus. Numa primeira etapa foram prospectadas condições de cultivo favoráveis à obtenção de metabólitos secundários com atividade biológica. Este trabalho foi guiado por ensaios biológicos e análises cromatográficas. As frações obtidas nos cultivos de escala ampliada foram submetidas a ensaios biológicos (leishmanicida, antimalárico, antimcrobiano e citotóxico). As frações diclorometânicas e em acetato de etila de ambos os fungos apresentaram resultados promissores em ensaios antitumorais e leishmanicidas. Em seguida, estas frações foram submetidas a processos cromatográficos que permitiram o isolamento de substâncias, cujas estruturas químicas foram elucidadas por meio do uso de técnicas de RMN, espectrometria de massas, UV, IV, rotação óptica (?D) e difração de raio-X. A partir de cultivos de B. bassiana foram obtidos compostos da classe das piridonas: piridovericina, piridovericina-N-O-(4-O-metil-?-D-glucopiranosídeo) e 15-desóxi-piridovericina, sendo os dois últimos inéditos; e das aloxazinas: 7,8-dimetilaloxazina (lumicromo) e 1-metil-11-hidróxilumicromo, sendo este inédito. A partir dos cultivos de M. indicus foram obtidas substâncias de duas classes: cromenos e azafilonas. Neste trabalho foram isolados derivados cromenos: eugenitina, 6-metóxieugenina e 9-hidróxieugenina, os quais têm sido isolados de uma ampla variedade de plantas e fungos. As azafilonas são uma classe estruturalmente diversa de metabólitos fúngicos, conhecidos pigmentos com estrutura pirano-quinona que contêm um núcleo bicíclico altamente oxigenado e um centro quiral quaternário. Foram obtidas duas azafilonas conhecidas: austidiol e austidiol diacetato (produto de acetilação); e três azafilonas inéditas: dímero de austidiol, austidiol diidroisocumarina e austidiol cromeno. As três azafilonas inéditas de M. indicus apresentam um padrão não usual de conexão entre dois policetídeos aromáticos, uma ponte metilênica. O isolamento de tais moléculas reforça a hipótese de que a biossíntese ocorra com a participação de uma molécula de formaldeído. As substâncias purificadas foram submetidas aos ensaios biológicos para confirmar o potencial de suas frações geradoras. No ensaio citotóxico as azafilonas austidiol e austdiol diacetato e a piridona piridovericina mostraram-se ativas contra as linhagens tumorais avaliadas, embora em concentrações superiores aos padrões utilizados. Além disso, apresentaram algum grau de seletividade (não tóxicas para linfócitos humanos). Também nos ensaios leishmanicidas, austidiol, austidiol diacetato e piridovericina mostraram-se ativos, embora em níveis inferiores aos leishmanicidas padrões. De modo que, pode-se considerar que as azafilonas e piridonas são bons compostos líderes para a busca de agentes citotóxicos e leishmanicidas, uma vez que estas classes de compostos possuem dinamicidade biológica. Por fim, o isolamento e elucidação de novos metabólitos das classes azafilonas e piridonas contribuem para o enriquecimento destas importantes classes de metabólitos fúngicos, ao mesmo tempo, que evidenciam a importância dos fungos endofíticos e entomopatogênicos na química de produtos naturais.It is known that microorganisms are considered as promising source of bioactive molecules and endophytic and entomopathogenic fungi are included in this group. Therefore, we selected the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana and the endophytic fungus Mycoleptodiscus indicus to initiate the prospection aiming to determine the favorable growing conditions to obtain secondary metabolites with biological activity. This work was guided by biological assays and chromatographic analysis. The fractions obtained in the cultivation in a large scale were subjected to biological tests (leishmanicidal, antimalarial, antimicrobial and cytotoxic). The dichloromethane and ethyl acetate fractions of both fungi showed promising results in antitumor and leishmanicidal assays. Then, these fractions were subjected to chromatographic processes that allowed the isolation of compounds whose chemical structures were elucidated through the use of NMR techniques, mass spectrometry, UV, IR, ?D, and X-ray diffraction. From cultures of B. bassiana were obtained compounds from the pyridone class: pyridovericin, pyridovericin-N-O-(4-O-methyl-?-D-glucopyranoside) and pyridovericin-15-deoxy, being the latter two novel compounds; and alloxazine class: 7,8-dimethylalloxazine (lumichrome) and 1-methyl-11-hydroxylumichrome, being this last one unprecedented. From M. indicus cultures were obtained compounds from two classes: azaphilone and chromene. In this thesis we report the derivatives eugenitin, 6-methoxyeugenin and 9-hydroxyeugenin, which have been isolated from a wide variety of plants and fungi. Azaphilones are a class of structurally diverse fungal metabolites, known pigments with pyran-quinone structure and contains a highly oxygenated bicyclic core and a chiral quaternary center. Then, we obtained two known azaphilones: austdiol and austdiol diacetate (product of acetylation), and three unprecedent azaphilones: austdiol dimer, austdiol dihydroisocoumarin and austdiol chromen. The three new azaphilones from M. indicus have an unusual pattern of connection between two aromatic polyketides, a methylene bridge. The isolation of these molecules reinforces the hypothesis that the biosynthesis occurs with the participation of one formaldehyde molecule. The purified compounds were submitted to biological assays. In the cytotoxic assay the azaphilones austdiol and austdiol diacetate, and the pyridone pyridovericin displayed activity against tumor cell lines, although at higher concentrations than the standard compounds used. Moreover, there was some degree of selectivity, since the assayed compounds were not toxic to human lymphocytes. Also in leishmanicidal assays, austdiol, austdiol diacetate and pyridovericin displayed activity, although at levels lower than leishmanicidal standards. Thereby, it can be considered that azaphilone and pyridone compounds are good leader compounds to search for cytotoxic and leishmanicidal agents, since these classes of compounds have biological dynamicity. Finally, the isolation and elucidation of new metabolites belonging to azaphilone and pyridone classes contribute to the enrichment of these important fungal metabolites and, likewise, this study demonstrates the importance of endophytic and entomopathogenic fungi in natural products chemistry

Otmization of the growth conditions for Humicola grisea var. thermoidea, aiming the production and isolation of biologicaly active secondary metabolites.

O fungo Humicola grisea var. thermoidea foi submetido a diferentes condições de cultivo com o intuito de determinarem-se as melhores condições para produção de conídios, crescimento e produção de metabólitos secundários com atividade biológica. Para tal foram desenvolvidos experimentos avaliando dois parâmetros: meio fermentativo e tempo de incubação. Os meios fermentativos líquidos utilizados foram Czapek, Jackson e Vogel em condições de agitação (120 rpm), e os tempos avaliados foram 72, 96, 120, 144, 168 e 192 horas. Também foi desenvolvida cultura por fermentação em substrato sólido, meio de arroz enriquecido, em diferentes tempos de incubação, sendo escolhido o período de 60 e 90 dias como os mais promissores. Todos os cultivos foram realizados em temperatura de 40ºC. Dos cultivos em meio líquido foram obtidos extratos acetoetílicos e butanólicos dos filtrados das culturas e metanólicos dos micélios. Dos cultivos a partir do meio sólido foram obtidos extratos acetoetílicos. Os extratos foram avaliados pela técnica de bioautografia na concentração de 30 mg/mL (10 L), utilizando-se como indicadores biológicos as cepas Kocuria rhizophila (ATCC 9341), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC 14885). Os extratos acetoetílicos e metanólicos obtidos a partir dos cultivos em Czapek e Vogel, nos tempos 144, 168 e 192 horas se mostraram ativos contra as cepas K. rhizophila e S. aureus. Os extratos obtidos do meio sólido e o extrato acetoetílico (192 horas) obtido do meio de cultivo de Czapek foram avaliados pelo método de microdiluição em microplaca com o objetivo de determinarem-se os valores de CIM, utilizando como microrganismos indicadores K. rhizophila e S. aureus. O extrato mais promissor foi o extrato acetoetílico do cultivo em meio de arroz enriquecido, durante 90 dias, sendo os valores de concentração inibitória mínima de 350 g/mL e de 250 g/mL, contra S. aureus e K. rhizophila, respectivamente. Os extratos foram avaliados por cromatografia líquida de alta eficiência, sendo a princípio considerados promissores os extratos em acetato de etila de Czapek e arroz enriquecido. O fungo foi cultivado em arroz (60 e 90 dias), devido ao maior rendimento, manejo mais simples, menores valores de concentração inibitória mínima quando comparados aos cultivos desenvolvidos nos meios fermentativos líquidos avaliados. Deste modo, foi promovida ampliação da escala de cultivo em meio sólido e os extratos obtidos foram submetidos a processos cromatográficos visando o isolamento de substâncias ativas. Foram isoladas seis substâncias, e elucidadas três: dimetil tereftalato, ácido p-hidroxifenilacético e uma lactama, a qual foi isolada pela primeira vez de fungos e havia sido isolada apenas da esponja marinha (Halichondria melanodocia) infestada por alga. Os resultados dos ensaios de microdiluição em microplaca de tais substâncias se mostraram bastante discretos. Entretanto, outros ensaios biológicos, dentre eles, antitumorais e antiparasitários serão realizados para as substâncias isoladas.The fungos Humicola grisea var. thermoidea was submmited to different growth conditions, aiming to determine the best condition for the conidia production, mycelia growth and production of secondary metabolites bearing biological activities, as well. For that, it was evaluated both deferent fermentative media (Czapek, Jackson and Vogel) and incubation time (72, 96, 120, 144, 168 e 192 hours), under 120 RPM. The fungus was also cultivated in solid medium using enriched rice in different times of incubation in two batches of 60 and 90 days of fermentation. All fermentations were undertaken at 40ºC. From the fermetation in liquid media it was obtained the extracts in ethyl acetate and n- butanol, from the broth, respectively, and in methanol from the mycelium. From the solid media (rice) it was obtained the ethyl acetate extract. The obtained extracts were submitted to bioautography assay by applying 10 L of a solution containing 30 mg/mL of each extract against the following bacteria strains: Kocuria rhizophila (ATCC 9341), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) and Pseudomonas aeruginosa (ATCC 14885). The extracts em ethyl acetate and methanol obtained from from Czapek and Vogel media at 144, 168 e 192 hours displayed activity against K. rhizophila and S. aureus. The extracts obtained from the solid medium and the ethyl acetate extract from the Czapek nediun at 192 hours were evaluated using the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) in microplates, aiming to determine the MIC values for these extracts against both K. rhizophila and S. aureus. The most active extract (ethyl acetate) was the one obtained from solid media cultivated for 90 days, furnishing the MIC values of 350 g/mL and 250 g/mL against S. aureus and K. rhizophila, respectively. All the obtained extracts were submitted to HPLC chromatography and the best chromatographic profiles were displayed by both ethyl acetate extracts from Czapek and enriched rice media. The cultivation in rice media was simple and produced the highest yield of extract, as well as displayed the lowest CIM in comparison with the extracts obtained from the broth of liquid media. Therefore, the fungus was cultivated in a larger scale in rice aiming to obtain enough amount of ethyl acetate extract to allow the isolation of the major active compounds by chromatographic means. Thus, six compounds were isolated, from which three were identified so far: dimethyl tereftalate, p-hidroxyphenylacetic acid and the one lactam. The lactam was isolated for the firs time from a soil fungus, and it was previous isolated only from a marine sponge (Halichondria melanodocia) infested by algae. However, the obtained MIC values for these compounds were very high. Even though, other biological assays, such as: anticancer and antiparasitic, among other will be undertaken to evaluate the potential of the isolated compounds

delta-Lactam derivative from thermophilic soil fungus exhibits in vitro anti-allergic activity

From cultures of thermophilic soil fungus Humicola grisea var thermoidea, a delta-lactam derivative (3-(2-(4-hydroxyphenyl)-2-oxoethyl)-5,6-dihydropyridin-2( 1H)-one) that displayed anti-allergic activity was isolated, which was predicted by in silico computational chemistry approaches. The in vitro anti-allergic activity was investigated by beta-hexosaminidase release assay in rat basophilic leukaemia RBL-2H3 cells. The delta-lactam derivative exhibited similar anti-allergic activity (IC50 = 18.7 +/- 6.7 mu M) in comparison with ketotifen fumarate (IC50 = 15.0 +/- 1.3 mu M) and stronger anti-allergic activity than azelastine (IC50 = 32.0 mu M). Also, the MTT cytotoxicity assay with RBL-2H3 cells showed that delta-lactam does not display cytotoxicity at concentrations lower than 50 mu M. This study suggests that the delta-lactam derivative has the potential to be used as a lead compound in the development of anti-allergic drugs for clinical use in humans.CAPESCAPESCNPqCNPqFAPESP [04/07935-6]FAPES