The influence of Nrf2 transcription factor and heme oxygenase-1 on osteoclastogenesis

Wstęp: Osteoklastogeneza to proces polegający na tworzeniu się osteoklastów, odpowiedzialnych za resorpcję kości, z komórek prekursorowych linii monocytarno-makrofagowej. Zwiększona liczba i aktywność osteoklastów jest związana z intensywną demineralizacją kości, występującą między innymi podczas osteoporozy. Ostatnie doniesienia naukowe sugerują, iż czynnik transkrypcyjny Nrf2 oraz regulowana przez niego oksygenaza hemowa-1 (HO-1), mogą mieć istotny wpływ na osteoklastegenezę, jednak dokładny mechanizm wymaga dalszego zbadania.Cel: Celem pracy było zbadanie wpływu niedoboru Nrf2 i HO-1 na różnicowanie makrofagów pochodzenia szpikowego (BMM) do osteoklastów.Materiały i metody: Jako modelu użyto myszy z wyłączoną ekspresja Nrf2 lub HO-1 oraz myszy typu dzikiego jako kontroli. Szpik kostny izolowano z kości piszczelowych i udowych, a następnie hodowano w obecności czynnika wzrostu kolonii makrofagów (M CSF) przez 3 dni, w celu uzyskania makrofagów pochodzenia szpikowego (BMM). Przez kolejne 3 dni BMM były stymulowane M-CSF oraz ligandem receptora aktywującego NFκB (RANKL) w celu uzyskania osteoklastów. W dniu 3 sprawdzano ekspresję genów specyficznych dla makrofagów, natomiast w dniu 6, mierzono ekspresję markerów osteoklastów takich jak: czynnika jądrowego pobudzonych limfocytów T (NFATc1), receptora kalcytoniny (CALCR), katepsyny K (CTSK) oraz integryny β 3 (ITGβ3) przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym. W dniu 6 BMM stymulowane RANKL barwiono na obecność aktywnej kwaśnej fosfatazy (TRAP), będącej markerem dojrzałych osteoklastów.Wyniki: Nie zaobserwowano różnic w ekspresji Mac-1 i F4/80 u BMM po stymulacji M CSF niezależnie od genotypu. Zaobserwowano, że BMM z niedoborem Nrf2 intensywniej różnicowały do komórek TRAP+ w porównaniu do BMM Nrf2+/+, podczas gdy u BMM HO 1-/- odnotowano upośledzone tworzenie się osteoklastów w porównaniu do grupy kontrolnej. Wyniki te potwierdzono wyższą ekspresją markerów osteoklastów w populacji Nrf2-/-, oraz niższą w przypadku HO-1-/-, względem odpowiednich grup kontrolnych. Z kolei dodatkowa stymulacja sulforafanem spowodowała upośledzenie różnicowanie BMM Nrf2+/+ do osteoklastówPodsumowanie: Niedobór HO-1 u BMM upośledza tworzenie osteoklastów, podczas gdy brak Nrf2 nasila osteoklastogenezę.Introduction: Osteoclastogenesis is a process of bone-resorbing osteoclasts (OCL) formation from monocyte-macrophage precursor cells. Increased number and activity of OCLs are associated with intense bone demineralization in disorders such as osteoporosis. Recent studies suggested the involvement of the cytoprotective Nrf2 transcription factor and its target, heme oxygenase-1 (HO-1) in osteoclastogenesis, however, detailed mechanism still need to be examined. Aim: The aim of the study was to investigate the effect of Nrf2 and HO-1 deficiency in murine bone marrow macrophages on osteoclasts differentiation.Materials and methods: As a model we used Nrf2- or HO-1-deficient mice and appropriate wild-type mice as a control. Bone marrow cells were isolated from tibial and femoral bones and stimulated for 3 days with macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) to obtain bone marrow macrophages (BMMs) and for the next 3 days with M-CSF and receptor activator of nuclear factor kB ligand (RANKL) for OCLs differentiation. At day 3 the level of BMM surface markers (F4/80, Mac-1) were analyzed, while at day 6 the level of OCL markers were checked such as nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1 (NFATc1), calcitonin receptor (CALCR), cathepsin K (CTSK) and integrin β 3 (ITGβ3) using real-time PCR. At day 6 RANKL-stimulated BMMs were stained also for tertrate-resistant acid phosphatase (TRAP), an enzyme specific for mature OCLs.Results: There were no difference in Mac-1 and F4/80 expression in BMM after treatment with M-CSF irrespective of the genotype. However, using TRAP activity assay we showed that Nrf2 deficiency resulted in higher number of OCLs , while less TRAP+ cells were detected when HO-1 was absent, as compared to appropriate controls. Osteoclasts-specific genes were upregulated in RANKL-stimulated Nrf2-/- cells comparing to Nrf2 +/+, while opposite results were obtained in HO-1-/- cells which demonstrated downregulation of OCL specific genes comparing to HO-1+/+. Moreover, addition of sulforaphane to RANKL-stimulated Nrf2+/+ BMMs showed inhibition of OCLs formation. Conclusions: HO-1 deficiency in BMMs impairs osteoclasts formation, while the lack of Nrf2 enhances osteoclastogenesis

Nrf2 regulates angiogenesis : effect on endothelial cells, bone marrow-derived proangiogenic cells and hind limb ischemia

Aims: Nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2), a key cytoprotective transcription factor, regulates also proangiogenic mediators, interleukin-8 and heme oxygenase-1 (HO-1). However, hitherto its role in blood vessel formation was modestly examined. Particularly, although Nrf2 was shown to affect hematopoietic stem cells, it was not tested in bone marrow-derived proangiogenic cells (PACs). Here we investigated angiogenic properties of Nrf2 in PACs, endothelial cells, and inflammation-related revascularization. Results: Treatment of endothelial cells with angiogenic cytokines increased nuclear localization of Nrf2 and induced expression of HO-1. Nrf2 activation stimulated a tube network formation, while its inhibition decreased angiogenic response of human endothelial cells, the latter effect reversed by overexpression of HO-1. Moreover, lack of Nrf2 attenuated survival, proliferation, migration, and angiogenic potential of murine PACs and affected angiogenic transcriptome in vitro. Additionally, angiogenic capacity of PAC Nrf2(−/−) in in vivo Matrigel assay and PAC mobilization in response to hind limb ischemia of Nrf2(−/−) mice were impaired. Despite that, restoration of blood flow in Nrf2-deficient ischemic muscles was better and accompanied by increased oxidative stress and inflammatory response. Accordingly, the anti-inflammatory agent etodolac tended to diminish blood flow in the Nrf2(−/−) mice. Innovation: Identification of a novel role of Nrf2 in angiogenic signaling of endothelial cells and PACs. Conclusion: Nrf2 contributes to angiogenic potential of both endothelial cells and PACs; however, its deficiency increases muscle blood flow under tissue ischemia. This might suggest a proangiogenic role of inflammation in the absence of Nrf2 in vivo, concomitantly undermining the role of PACs in such conditions. Antioxid. Redox Signal. 20, 1693–1708