Rapid Identification of Histoplasma capsulatum Directly from Cultures by Multiplex PCR

The multiplex PCR developed from a suspension of the yeast fungi correctly identified fifty-one clinical of H. capsulatum var. capsulatum strains isolated from clinical samples and soil specimens. The multiplex PCR was developed by combining two pairs of primers, one of them was specific to the H. capsulatum and the other one, universal for fungi, turned out to be specific to H. capsulatum, regardless of the fungus isolate studied. Primers designed to amplify a region of about 390-bp (Hc I-Hc II) and a region of approximately 600-bp (ITS1-ITS4) were used to identify a yeast isolated as H. capsulatum when both regions could be amplified. Absolute agreement (100 % sensitivity) could be shown between this assay and the cultures of H. capsulatum according to their morphological characteristics. Failure to amplify the target DNA sequence by PCR with primers Hc I-Hc II in the presence of the ITS1-ITS4 amplicon in isolates of P. brasiliensis, Cryptococcus neoformans, Trichosporon spp, Candida glabrata, C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei, or Penicillium marneffei was an unequivocal sign of the high specificity of this assay. The assay specificity was also found to be 100 %. Incipient yeast forms obtained from clinical samples were identified as H. capsulatum by the PCR assay described before the morphological characteristics were registered shortening the time of diagnosis.Fil: Elías, Nahuel Alejandro. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Departamento de Microbiología. Área Virología; ArgentinaFil: Cuestas, María Luján. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Departamento de Microbiología. Área Virología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Sandoval, Macarena. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Departamento de Microbiología. Área Virología; ArgentinaFil: Poblete, Gabriela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Departamento de Microbiología. Área Virología; ArgentinaFil: López Daneri, Gabriela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Departamento de Microbiología. Área Virología; ArgentinaFil: Jewtuchowicz, Virginia Marta. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Departamento de Microbiología. Área Virología; ArgentinaFil: Iovannitti, Cristina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Departamento de Microbiología. Área Virología; ArgentinaFil: Mujica, María Teresa. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Departamento de Microbiología. Área Virología; Argentin

RNA extraction from the yeast candida parapsilosis sensu stricto using two commercial methods based on purification by silica columns

Good quality RNA needs to be obtained in order to study gene expression. Different RNA extraction methods have been described, but RNA quality and yield may vary among the different techniques and biological study species. To date, there is no standardized method for extraction and purification of RNA from Candida genus yeasts. The few available papers on the subject apply mainly to filamentous fungi and have produced poor results for extraction techniques based on manual or in-house IVD methods. The aim of this study was therefore to compare two commercial RNA extraction and purification systems using silica columns (Qiagen and Zymo Research) with Candida parapsilosis sensu stricto as model organism. This yeast has been identified in recent papers as the second most frequently isolated Candida species in the oral cavity. In the past decade, it has been the object of increasing medical interest because it is one of the main causes of candidemia in both adults and preterm neonates. In view of this background, we consider the study of Candida parapsilosis sensu stricto transcriptome and its variations according to environmental changes to be a priority. In this experimental study, 19 fungal isolates were processed using Qiagen and 17 isolates using Zymo Research. The results suggest that Qiagen lysis buffer RLT is essential for obtaining better quality RNA product

Optimización de RT-PCR para la evaluación de RNA de la levadura cándida parapsilosis sensu stricto por dos métodos comerciales basados en sistema de purificación por columnas de sílice

La especie Candida parapsilosis sensu stricto ha concentrado el interés médico como un patógeno nosocomial importante, siendo actualmente, la segunda levadura más aislada en candidemias e infecciones relacionadas a dispositivos médicos. Con el advenimiento de las tecnologías ómicas, como la genómica, la transcriptómica, la proteómica se ha mejorado el diagnóstico en micología y el conocimiento de las interacciones entre el huésped y su micobioma. Hasta el momento, no existe una metodología estandarizada para la extracción y purificación de RNA a partir de levaduras del género Candida, etapa crítica para realizar estudios de la expresión génica. Objetivo. Optimizar un procedimiento de RT-PCR para evaluar la extracción y purificación de RNA de aislamientos clínicos de C. parapsilosis sensu stricto, para su posterior estudio transcripcional, comparando concentración y pureza de dos equipos comerciales por columnas de sílica. Materiales y Métodos. Se utilizó una colección de 36 aislamientos caracterizados por métodos moleculares como Candida parapsilosis sensu stricto. A partir de aislamientos en medio Sabouraud y caldo YPD (peptona, dextrosa y extracto de levadura), se obtuvieron esferoplastos y se ensayaron dos equipos comerciales basados en extracción de RNA mediante columnas, según indicaciones del fabricante. Las soluciones de RNA obtenidas se cuantificaron con espectrofotómetro, utilizando una longitud de onda de 260, la relación A260/230 y se documentó la integridad del RNA y la contaminación con DNA genómico, mediante visualización directa en gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. Los resultados de pureza y rendimiento fueron procesados y analizados en Microsoft excel 2010 y paquete estadístico InfoStat 2016. Para transcribir el RNA a cDNA se utilizó retrotranscriptasa. Con el cDNA obtenido se procedió a realizar la RT-PCR mediante cebadores para amplificación de la región ITS, previamente optimizada. Resultados. El sistema Zymo research aportó el mayor rendimiento con una diferencia estadísticamente significativa sobre el sistema Qiagen (p=0,0015). E sistema Qiagen resultó más eficaz para generar un producto con menor contaminación de proteínas. Mientras que el sistema de Zymo research demuestra ser más efectivo a la hora de otorgar un producto de RNA menos contaminado con fenoles y carbohidratos. En ambos casos se obtuvo diferencias estadísticamente significativas. Conclusiones. Ambos procedimientos permitieron obtener RNA y cDNA de buena calidad y concentración en la especie Candida parapsilosis sensu stricto y son óptimos para utilizar en estudios transcripcionales. La elección del método de extracción deberá estar sujeto a varios aspectos, como el presupuesto, el organismo, y especialmente el objetivo del experimento.Buenos Aire

Candida parapsilosis sensu stricto can act as a pathobiont in conditions of oral dysbiosis

Publicaciones recientes han informado una alta prevalencia de C. parapsilosis sensu stricto en los nichos de la cavidad oral. Nuestro grupo de investigación realizó un estudio piloto en 2017 que mostró que, del complejo de psilosis, C. parapsilosis sensu stricto es la especie más frecuentemente aislada de los nichos de la cavidad oral. En condiciones inflamatorias, la probabilidad de recuperarlo es casi cuatro veces mayor y presenta una mayor capacidad de formación de biopelículas in vitro, diferenciándose significativamente de los aislados de la misma especie obtenidos en condiciones de eubiosis. Esto nos llevó a plantear la hipótesis de que un entorno oral en disbiosis sobreregula los genes virulentos, promoviendo un fenotipo más patógeno. En consecuencia, decidimos reevaluar la in vitroensayo de formación de biopelículas utilizando una muestra más grande, en dos condiciones nutricionales, utilizando métodos colorimétricos para la cuantificación. Además, los resultados obtenidos fueron validados mediante técnicas de imagen. Para ambas condiciones clínicas (eubiosis y disbiosis), predominó el fenotipo de alta formación de biopelícula con ambos métodos de lectura y para ambas condiciones nutricionales probadas. XTT mostró una diferencia significativa entre los valores de absorbancia para los aislados de disbiosis bucal y eubiosis (p = 0,0025). Las células de C. parapsilosis sensu stricto que colonizan los nichos de la cavidad oral son básicamente formadores de biopelículas fuertes, independientemente de las condiciones de crecimiento in vitro. Sin embargo, la cavidad oral en la disbiosis probablemente promueve la virulencia en esta especie debido a modificaciones epigenéticas heredables.Recent publications have reported high prevalence of Candida parapsilosis Sensu Stricto in oral cavity niches. Our research group performed a pilot study in 2017 which showed that of the psilosis complex, Candida parapsilosis Sensu Stricto is the species most frequently isolated from oral cavity niches. Under inflammatory conditions, the probability of recovering it is almost four times higher, and it displays high- er biofilm-forming capacity in-vitro, differing significantly from isolates of the same species obtained in conditions of eubiosis. This led us to hypothesize that an oral environment in dysbiosis overregulates vir- ulent genes, promoting a more pathogenic phenotype. Accordingly, we decided to re-evaluate the in-vitro biofilm formation assay using a larger sample, under two nutritional conditions, using colorimetric meth- ods for quantification. In addition, the results obtained were validated by imaging techniques. For both clinical conditions (eubiosis and dysbiosis), high biofilm forming phenotype predominated with both reading methods, and for both nutritional conditions tested. XTT showed significant difference between absorbance values for isolates from buccal dysbiosis and eubiosis (P=0.0025). Candida parapsilosis Sensu Stricto cells that colonize oral cavity niches are basically strong biofilm formers, regardless of in vitro growing conditions. However, the oral cavity in dysbiosis probably promotes virulence in this species due to inheritable epigenetic modifications

Ecological imbalance of the oral cavity improves the virulence of candida parapsilosis sensu stricto

Candida parapsilosis sensu stricto is the second to third most frequent cause of candidemia. Studies place this yeast as a frequent colonizer of niches of the oral cavity, predominantly in pathological conditions. We hypothesize that a buccal environment in dysbiosis enhances the virulence of C. parapsilosis sensu stricto. Objective: To evaluate at the phenotype and molecular level the production of biofilm in oral isolates of Candida parapsilosis sensu stricto, and correlate the results with the clinical origin (dysbiosis versus eubiosis). Material and methods: The biofilm-forming ability was compared in 50 oral isolates of Candida parapsilosis sensu stricto obtained from patients with and without oral dysbiosis; by quantification of biofilm biomass and metabolic activity. The results were corroborated by optical and confocal fluorescence microscopy, and correlated with the transcriptional activity of CPH2, by RT-qPCR. The data were analyzed by Excel 2010, and InfoStat 2018, with a 95% confidence interval. Results: The metabolic activity in biofilm was significantly higher in oral dysbiosis relative to control (p = 0.0025). Basal expression of CPH2 increased 2.8 times more in oral dysbiosis related to the control condition, and showed no significant differences with pathogenic isolates of this same yeast, derived from onychomycosis lesions. Conclusion: The oral cavity in dysbiosis increases the virulence of C. parapsilosis sensu stricto due to possible changes in epigenetic marks. This finding suggests that the oral cavity in dysbiosis may be an alternative route to the skin in the epidemiology of nosocomial candidemia.Candida parapsilosis sensu stricto is the second to third most frequent cause of candidemia. Studies place this yeast as a frequent colonizer of niches of the oral cavity, predominantly in pathological conditions. We hypothesize that a buccal environment in dysbiosis enhances the virulence of C. parapsilosis sensu stricto. Objective: To evaluate at the phenotype and molecular level the production of biofilm in oral isolates of Candida parapsilosis sensu stricto, and correlate the results with the clinical origin (dysbiosis versus eubiosis). Material and methods: The biofilm-forming ability was compared in 50 oral isolates of Candida parapsilosis sensu stricto obtained from patients with and without oral dysbiosis; by quantification of biofilm biomass and metabolic activity. The results were corroborated by optical and confocal fluorescence microscopy, and correlated with the transcriptional activity of CPH2, by RT-qPCR. The data were analyzed by Excel 2010, and InfoStat 2018, with a 95% confidence interval. Results: The metabolic activity in biofilm was significantly higher in oral dysbiosis relative to control (p = 0.0025). Basal expression of CPH2 increased 2.8 times more in oral dysbiosis related to the control condition, and showed no significant differences with pathogenic isolates of this same yeast, derived from onychomycosis lesions. Conclusion: The oral cavity in dysbiosis increases the virulence of C. parapsilosis sensu stricto due to possible changes in epigenetic marks. This finding suggests that the oral cavity in dysbiosis may be an alternative route to the skin in the epidemiology of nosocomial candidemia.Californi

Oral mucosa as a potential source of candidemia by Candida parapsilosis sensu stricto, under pathological conditions

Over the past 10 years, there have been increasingly frequent reports of colonization of niches in the oral cavity by Non-Candida Albicans Candida (NCAC) species. Among these species, Candida parapsilosis sensu stricto plays a major part both locally and systemically. Evidence shows that it may be the second most frequent yeast isolate, after Candida albicans, as commensal in the oral cavity and as pathogen in blood cultures of patients diagnosed with fungemia. Recent reports suggest that both its distribution and its virulence may be affected by environmental conditions and may increase in situations of oral dysbiosis. Based on this background, we hypothesize that oral mucosa in pathological condition may be a source of candidemia by Candida parapsilosis sensu stricto, when promoted by the conditions in the host. We reviewed the scientific databases in search of evidence which may support such hypothesis.Over the past 10 years, there have been increasingly frequent reports of colonization of niches in the oral cavity by Non-Candida Albicans Candida (NCAC) species. Among these species, Candida parapsilosis sensu stricto plays a major part both locally and systemically. Evidence shows that it may be the second most frequent yeast isolate, after Candida albicans, as commensal in the oral cavity and as pathogen in blood cultures of patients diagnosed with fungemia. Recent reports suggest that both its distribution and its virulence may be affected by environmental conditions and may increase in situations of oral dysbiosis. Based on this background, we hypothesize that oral mucosa in pathological condition may be a source of candidemia by Candida parapsilosis sensu stricto, when promoted by the conditions in the host. We reviewed the scientific databases in search of evidence which may support such hypothesis

Oral dysbiosis exacerbates candida parapsilosis sensu stricto biofilm production via up-regulation of the CPH2 biofilm master gene

Introduction: Candida parapsilosis sensu stricto is the second to third most frequent cause of candidemia. Studies place this yeast as a frequent colonizer of niches of the oral cavity, predominantly in pathological conditions. We hypothesize that a buccal environment in dysbiosis enhances the virulence of C. parapsilosis sensu stricto. Objective: To evaluate the phenotype and molecular level of the production of biofilm in oral isolates of Candida parapsilosis sensu stricto and correlate the results with the clinical origin (dysbiosis versus eubiosis). Materials and Methods: The biofilm-forming ability was compared in 50 oral isolates of Candida parapsilosis sensu stricto obtained from patients with and without oral dysbiosis; by quantification of metabolic activity. The results were corroborated by confocal fluorescence microscopy, and correlated with the transcriptional activity of CPH2, by RT-qPCR. The data were analysed by Excel 2010, and InfoStat 2018, with a 95% confidence interval. Results: The metabolic activity in biofilm was significantly higher in oral dysbiosis relative to control (p = 0.0025). Basal expression of CPH2 increased 2.8 times more in oral dysbiosis related to the control condition and showed no significant differences with pathogenic isolates of this same yeast, derived from onychomycosis lesions. Conclusion: The oral cavity in dysbiosis increases the virulence of C. parapsilosis sensu stricto due to possible changes in epigenetic marks. This finding suggests that the oral cavity in dysbiosis may be an alternative route to the skin in the epidemiology of nosocomial candidemia

The oral cavity promotes virulence of candida parapsilosis sensu stricto via up- regulation of BCR1

andida parapsilosis sensu stricto se comporta como un colonizador frecuente de nichos de la cavidad bucal, predominantemente en condiciones patológicas. Los estudios han sugerido la influencia del nicho ecológico en la virulencia de C. parapsilosis . Teniendo en cuenta estos antecedentes, planteamos la hipótesis de que las condiciones del nicho afectan la virulencia de C. parapsilosis sensu stricto debido a cambios epigenéticos heredables. Medir y comparar la virulencia, a nivel fenotipo y molecular, de cepas clínicas de C. parapsilosis sensu stricto de diferentes nichos y condiciones clínicas. Se comparó la capacidad de formación de biopelículas en 20 aislados clínicos de C. parapsilosissensu stricto obtenido de sangre (candidemia), piel (onicomicosis) y cavidad oral (eubiosis y disbiosis); por cuantificación de biomasa de biopelículas y actividad metabólica. Los resultados fueron corroborados por microscopía óptica y correlacionados con la expresión basal del regulador global de biopelícula BCR1 por RT-PCR. La producción de biopelículas y la expresión basal de BCR1 fueron significativamente diferentes según el nicho ecológico y el origen clínico de los aislamientos. La cavidad oral ejerce un papel preponderante en la modulación de la virulencia de esta levadura mediante la regulación de BCR1. La capacidad de formación de biopelículas en C. parapsilosis sensu stricto depende de la cepa, pero puede ser modulada por las condiciones ambientales o el nicho ecológico a través de la regulación epigenética de reguladores globales de biopelículas como BCR1.Candida parapsilosis sensu stricto behaves as a frequent colonizer of niches of the oral cavity, predominantly in pathological conditions. Studies have suggested the influence of the ecological niche in the virulence of C. parapsilosis. Given this background, we hypothesize that the conditions of the niche affect the virulence of C. parapsilosis sensu stricto due to inheritable epigenetic changes. Measure and compare the virulence, at the phenotype and molecular level, of clinical isolates of C. parapsilosis sensu stricto from different niches and clinical conditions. Biofilm-forming ability was compared in 20 clinical isolates of C. parapsilosis sensu stricto obtained from blood (candidemia), skin (onychomycosis), and oral cavity (eubiosis and dysbiosis); by quantification of biofilm biomass, and metabolic activity. The results were corroborated by optical microscopy and correlated with the basal expression of the global biofilm regulator BCR1 by RT-PCR. Biofilm production and baseline BCR1 expression were significantly different depending on the ecological niche and the clinical origin of the isolates. The oral cavity exerts a preponderant role in the modulation of the virulence of this yeast via regulation of BCR1. The biofilm-forming ability in C. parapsilosis sensu stricto is dependent on the strain, but can be modulated by environmental conditions or ecological niche via epigenetic regulation of global biofilm regulators such as BCR1

Distribución y sensibilidad antifúngica del complejo cándida parapsilosis en diferentes nichos de cavidad bucal de una cohorte de pacientes argentinos

Candida parapsilosis es un complejo formado por tres especies: Candida parapsilosis sensu stricto, C. orthopsilosis y C. metapsilosis, debido a su heterogeneidad genética, pero que fenotípicamente son indistinguibles1. Actualmente, es la segunda levadura más aislada en infecciones del torrente sanguíneo1,2 y en sitios de cavidad bucal3, siendo sensu stricto y metapsilosis, las especies mayormente recuperadas de nichos bucales tanto en pacientes sanos3 como inmunocomprometidos4. Se ha reportado disparidad en la susceptibilidad antifúngica entre las especies de este complejo5,6,7,8; no existiendo datos en Argentina sobre su distribución y comportamiento en cavidad bucal. Objetivo: Caracterizar por métodos moleculares una colección de aislamientos Argentinos previamente identificados como C. parapsilosis, de diferentes nichos bucales, en una cohorte de pacientes con distintas situaciones clínicas. Materiales y Métodos: El estudio experimental se realiza en 41 aislamientos clínicos del complejo C. parapsilosis obtenidos de pacientes ambulatorios, hospitalizados y de diferentes nichos de cavidad bucal, recolectados en estudios de investigación previos. Para la tipificación molecular se recuperaron los aislamientos guardados e identificados previamente como C. parapsilosis en medios cromogénico diferencial para Candida, Sabouraud y posteriormente en caldo YPD (extracto de levadura, peptona y carne). Se empleó la técnica de ruptura de pared con zymolasa y el protocolo de la Quiagen (Quiam blodd DNA kit) para la extracción de ADN. La caracterización molecular se efectúa con PCR de punto final, empleando cebadores específicos (CPAR, CPAF, COOR, COOF, CMEF, CMER) derivados de secuencias únicas contenidas en el espaciador transcripcional interno 1 (ITS 1)-5.8rRNA-ITS2 del ADN ribosomal fúngico. Los datos serán validados mediante secuenciación por Sanger. La sensibilidad in vitro de los aislamientos frente a azoles, equinocandinas, anfotericina B y flucytosina es evaluada con CIM (Concentración inhibitoria mínima), bajo las normas CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) mediante método automatizado Vitek2 (Biomerieux). Los datos son procesados en el programa Excel; empleando STADISTICX 7.0 y SPSS versión 11.0 para el análisis. La significancia estadística es estimada con prueba Chi cuadrado, empleando un nivel de confianza del 95%. Resultados preliminares: De los 41 aislamientos caracterizados, 31 (75.6%) son positivos para la especie sensu stricto (Fig.1), de los cuales 22 (70.9%) provienen de mucosa bucal, y 9 (29.0%) de surco gingival. El 77.4% (24/31) de los aislamientos positivos para sensu stricto se recuperaron en condiciones bucales inflamatorias (X2 p=0.0048) y el 54.8% (17/31) provienen de pacientes con diversas formas de aparatología intraoral. Hasta el momento se ha evaluado la sensibilidad antifúngica (Tabla 1) en 19 de las 31 cepas caracterizadas como C. parapsilosis sensu stricto, de las cuales 18 (94.7%) fueron sensibles a los 6 antimicóticos testeados (fluconazol, voriconazol, caspofungina, micafungina, anfotericina B y flucytosina). Solo 1 (5.2%) cepa sensu stricto resultó resistente tanto a fluconazol (MIC: 4 mg/L) como a caspofungina (MIC: >=4mg/L), y mostrando una sensibilidad intermedia a voriconazol (MIC:<=0.25 mg/L). Estos resultados concuerdan con los de Miranda, et al9. 2011; Treviño Rangel et al1. 2011; y García, et al10. 2012; quienes informaron resistencia y/o susceptibilidad reducida a fluconazol, voriconazol y caspofungina para la especie sensu stricto. Dos trabajos (Silva et al11. 2009 y Canton et al5. 2011) han informado resistencia de la especie sensu stricto a anfotericina B, lo cual se contrapone con nuestros resultados. No encontramos ningún estudio que haya evaluado la susceptibilidad in vitro de C. parapsilosis a flucytosina. Conclusiones: C. parapsilosis sensu stricto es un colonizante habitual de mucosa oral bajo condiciones patológicas, y muestra una respuesta favorable a un amplio grupo de antifúngicos, sin embargo sigue existiendo disparidad en los resultados de sensibilidad antifúngica entre los diferentes trabajos y zonas geográficas.Buenos Aire