Revistando o genoma de Eimeria spp.: resquícios de marcadores de patogenicidade (ROP, SAG e pseudogenes) de coccidiose aviária

TCC(graduação) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Biológicas. Biologia.A coccidiose aviária é uma doença causada por sete espécies do gênero Eimeria, pertencentes ao filo Apicomplexa, caracterizado principalmente pela presença de uma região denominada complexo apical. A coccidiose aviária causa perdas à indústria avícola na ordem de milhões de dólares anualmente, de modo que o estudo do conteúdo genômico e produtos gênicos destes parasitos pode auxiliar no desenvolvimento de métodos de diagnóstico, profilaxia e vacinação. De acordo com a literatura, os genes pertencentes às famílias gênicas ROP e SAG são os principais fatores responsáveis pela patogenicidade do gênero. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi remontar os genomas, predizer e anotar os seus produtos gênicos, assim como buscar pseudogenes marcadores das famílias ROP e SAG nas sete espécies de Eimeria causadoras da coccidiose aviária. Primeiramente, foram obtidos os dados de sequenciamento disponíveis na base de dados do GenBank e, em seguida, efetuado o controle de qualidade e montagem dos genomas com base em referência. Realizou-se a predição de proteínas, RNAs e pseudogenes, sendo que suas funções foram estabelecidas com base em similaridade com os bancos de dados SwissProt e ToxoDB. Todas as montagens apresentaram melhoria nos indicadores, com destaque para a redução no número de scaffolds, cuja menor redução foi de 17% para E. necatrix e a maior redução foi de 73%, para E. brunetti. A melhoria dos indicadores foi possível sem perda de informação, ou seja, conteúdo GC, tamanho de genoma e número de repetições mantiveram-se semelhantes aos genomas depositados no GenBank. As predições de RNAs acompanham esta tendência, mantendo o número de genes dos genomas de referência. Foram preditos snoRNAs, cuja comparação com as respectivas referências não é possível, de modo que a identificação desses produtos pode auxiliar a formular e responder perguntas futuramente. Houve um salto no número de proteínas preditas em todos os genomas, bem como a diminuição do número de proteínas hipotéticas. As famílias ROP e SAG foram identificadas em níveis semelhantes ao encontrado nas referências. Os pseudogenes preditos mostram que apenas a família SAG deixa marcas no genoma de possíveis inativações ou fragmentações de genes ao longo do processo evolutivo. Para a família ROP poucos pseudogenes foram identificados. A predição de pseudogenes provoca dúvidas sobre a possível função regulatória destas sequências, já descrita na literatura, mas ainda não identificados para os parasitos causadores da coccidiose aviária. Deste modo, este trabalho representa um salto na melhoria dos genomas e identificação de novas estruturas que possam vir a contribuir com novas pesquisas e estratégias de mitigação da doença

Estudo da aplicabilidade de sequenciamento shotgun por nanoporos para detecção viral em esgoto sanitário de Canasvieiras - Florianópolis-SC

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2023.A vigilância genômica é uma importante ferramenta para detecção e monitoramento da dispersão de patógenos, e pode ser utilizada para o acompanhamento de mutações, emergência de variantes e identificação de mecanismos de escape imunológico. No contexto da saúde única, em que a saúde humana, animal e do ecossistema estão interligadas e interdependentes, a vigilância genômica possui aplicabilidade à detecção de disseminação de agentes microbianos resistentes a tratamento. A detecção de vírus em esgoto por qPCR já foi empregada para monitoramento de surtos de poliomielite, Ebola e, recentemente, SARS-CoV-2. O protocolo de concentração viral baseado no uso de Polietileno Glicol (PEG) como agente concentrador é amplamente utilizado para ensaios que visam concentrar e na sequência detectar tais partículas usando métodos moleculares e de cultura celular. Florianópolis, por ser uma cidade turística, apresenta um aumento populacional no verão, fator que aumenta a descarga de esgoto e possibilidade de transmissão de vírus de rota orofecal, fato que torna o esgoto sanitário uma ferramenta potencial para monitorar circulação e introdução viral no ambiente. Desta forma, este projeto buscou analisar o viroma total do esgoto de Canasvieiras, de dez meses do ano de 2021, como um ensaio acerca da aplicação da metodologia de concentração por PEG, que já é empregada para detecção molecular, para sequenciamento por nanoporos pela metodologia shotgun. Dois experimentos de sequenciamento foram realizados utilizando vírus controles, para: (i) detecção de concentração mínima necessária para recuperação de sequências virais; (ii) avaliação de protocolo de PEG seguido de pós protocolos de clarificação e remoção de DNA bacteriano livre. Levando em conta estes resultados, o protocolo PEG + clorofórmio e butanol (CB) foi empregado para concentração viral de dez amostras de dez meses da estação de tratamento de esgoto de Canasvieiras do ano 2021. Estas amostras foram sequenciadas, sem adição de quaisquer controles virais, pela metodologia shotgun em equipamento MinION Mk1C. Resultados prévios de detecção dos vírus da Hepatite A, Mastadenovírus humano (Adenovírus) e SARS-CoV-2 por qPCR foram utilizados como controles positivos das amostras, a fim de verificar a recuperação dos mesmos no sequenciamento. Em caráter comparativo, seis amostras de esgoto de outras cidades do estado de Santa Catarina foram utilizadas para obtenção do genoma de SARS-CoV-2, por meio de amplicons do genoma viral, sequenciados pela tecnologia Illumina. Diferentes concentrações de vírus controles não refletiram em diferenças na recuperação de fragmentos de leitura virais. A aplicação do protocolo de clarificação associado ao método de concentração por PEG recuperou, proporcionalmente, maior número de fragmentos de leitura viral, com cerca de 26% do total sequenciado. O emprego desta metodologia nas amostras de Canasvieiras/Florianópolis-SC, recuperou apenas os fagos Shigella phage SfMu e Escherichia phage Mu. Não foram recuperados vírus previamente identificados por metodologia molecular nas mesmas amostras. O protocolo de concentração PEG mesmo que associado ao CB, sem otimização experimental e variação de componentes (pH, temperatura, tempo de centrifugação) não apresentou eficiência na recuperação de vírus previamente detectados por RT-qPCR e qPCR nas amostras de esgoto de Canasvieiras. As sequências de SARS-CoV-2 obtidas a partir de amostras de esgoto não reconstruíram completamente o genoma do vírus, indicando desafios como inespecificidade de primers e degradação de material genético. Há, portanto, a perspectiva para desenvolvimento da otimização do processo baseado em PEG, teste de novas metodologia e estudos de iniciadores para PCR em multiplex visando o sequenciamento dos de genomas virais alvo a serem aplicados na vigilância genômica de vírus entéricos ou de rota ambiental.Abstract: Genomic surveillance is an important tool for detecting and monitoring the spread of pathogens and can be used to monitor mutations, and the emergence of variants and identify immune escape mechanisms. In the context of one health, in which human, animal and ecosystem health are interconnected and interdependent, genomic surveillance has applicability to detect the spread of treatment-resistant microbial agents. Virus detection in sewage by qPCR has already been used to monitor outbreaks of polio, Ebola and, recently, SARS-CoV-2. The viral concentration protocol based on the use of Polyethylene Glycol (PEG) as a concentrating agent is widely used for assays that aim to concentrate and then detect such particles using molecular and cell culture methods. Florianópolis, as a tourist city, experiences a population increase in the summer, a factor that increases sewage discharge and the possibility of transmission of viruses via the orofecal route, a fact that makes sanitary sewage a potential tool for monitoring circulation and viral introduction into the environment. In this way, this project sought to analyze the total virome of sewage from Canasvieiras, from ten months of the year 2021, as a test on the application of the PEG concentration methodology, which is already used for molecular detection, for nanopore sequencing using the methodology shotgun. Two sequencing experiments were carried out using control viruses, to: (i) detect the minimum concentration necessary to recover viral sequences; and (ii) evaluate of PEG protocol followed by postclarification protocols and removal of free bacterial DNA. Taking these results into account, the PEG + chloroform and butanol (CB) protocol was used for the viral concentration of ten samples from ten months of the Canasvieiras sewage treatment plant in the year 2021. These samples were sequenced, without adding any viral controls, using the shotgun methodology on MinION Mk1C equipment. Previous results of the detection of Hepatitis A viruses, human Mastadenovirus (Adenovirus) and SARS-CoV-2 by qPCR were used as positive controls for the samples, in order to verify their recovery in sequencing. On a comparative basis, six sewage samples from other cities in the state of Santa Catarina were used to obtain the SARS-CoV-2 genome, through viral genome amplicons, sequenced using Illumina technology. Different concentrations of control viruses did not reflect differences in the recovery of viral reading fragments. The application of the clarification protocol associated with the PEG concentration method recovered, proportionally, a greater number of viral reading fragments, with around 26% of the total sequenced. The use of this methodology in samples from Canasvieiras/Florianópolis-SC recovered only the Shigella phage SfMu and Escherichia phage Mu phages. No viruses previously identified by molecular methodology were recovered from the same samples. The PEG concentration protocol, even when associated with CB, without experimental optimization and variation of components (pH, temperature, centrifugation time) was not efficient in recovering viruses previously detected by RT-qPCR and qPCR in sewage samples from Canasvieiras. SARS-CoV-2 sequences obtained from sewage samples did not completely reconstruct the virus genome, indicating challenges such as primer unspecificity and degradation of genetic material. There is, therefore, the prospect of developing optimization of the PEG-based process, testing new methodology and studying primers for multiplex PCR aimed at sequencing target viral genomes to be applied in the genomic surveillance of enteric or environmental viruses

Pangenoma de Eimeria spp.: uma estratégia o entendimento da patogenia da coccidiose aviária e encontro de marcadores moleculares para diagnóstico diferencial

Seminário de Iniciação Científica e Tecnológica da UFSC - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Biológicas. Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia.A coccidiose aviária é uma doença causada por sete espécies do gênero Eimeria, que acometem frangos e causam grande perda econômica mundialmente. Devido a sua importância econômica, esses agentes infecciosos se tornaram objeto de estudo visando a aplicabilidade de metodologias para diagnóstico e vacinação. Métodos computacionais são comumente aplicados para tais objetivos, de forma a guiar testes in vivo. Um sequenciamento de DNA de segunda geração gera muitos fragmentos de pequenos tamanhos, que precisam ser alinhados de forma a gerar sequências contíguas maiores - até a máxima redução, chegando ao número de cromossomos da espécie. A montagem pode ocorrer de novo ou com base em um genoma ou sequência de referência. O pangenoma reflete a análise do material genético de grupos de espécies, que exprime o conjunto de genes compartilhados por todas elas (genoma central), conjuntos de espécies (genomas acessórios) e genes exclusivos de cada espécie (genomas exclusivos). Em termos funcionais, o pangenoma pode ser construído pela análise da ancestralidade das proteínas, a ortologia. Este projeto se propôs a montar os genomas de Eimeria spp.; construir o pangenoma destas espécies, a fim de identificar genes exclusivos e compartilhados entre as espécies. As montagens de genomas realizadas se mostram mais contíguas e com menos espaços em comparação com os genomas de referência. Os modelos de predição apresentaram muitas proteínas exclusivas. A anotação de proteínas não pôde ser realizada. A análise de ortologia, que reflete o pangenoma funcional das proteínas compartilhadas entre as espécies analisadas, resultou em 9.445 agrupamentos de proteínas, 7.781 agrupamentos ortólogos (compartilhados por pelo menos duas espécies) e 1.664 agrupamentos compostos por apenas uma espécie. O genoma central das sete espécies de Eimeria spp. estudadas neste trabalho é constituído por 24.564 proteínas compartilhadas, que constituem 2.678 agrupamentos ortólogos

Intestinal health of broilers challenged with Eimeria spp. using functional oil blends in two physical forms with or without anticoccidials

Abstract This study aimed to assess the impact of a commercial blend of functional oils, specifically cashew nutshell liquid and castor oil (FO), in two physical forms (solid: P; liquid: S), in comparison to a combination of virginiamycin and anticoccidials on the gut health of broilers challenged with coccidiosis. A total of 1760 1-day-old male chicks were randomly distributed in a study design with eight treatments. The treatments included: a control group (without additive), OFS_0.75_kg/t (FO spray), OFP_1.0_kg/t (FO powder), OFP_1.5_kg/t (FO liquid spray), Sal (anticoccidials), Sal_Vir (virginiamycin and anticoccidials), Sal_OFS_0.5_ kg/t (anticoccidials plus FO spray), and Sal_OFP_1.0_kg/t (anticoccidials plus FO powder). All birds were challenged with Eimeria spp. at 14 days. The physical form of FO did not affect performance and intestinal health parameters. At 42 days, broilers from the control and OFS_0.75 treatments were the lightest, while those from the Sal_Vir and Sal_OFP_1.0 treatments were the heaviest (P < 0.05). FO reduced the presence of Clostridium perfringens. The individual phytogenic additives did not prevent weight loss in birds challenged with Eimeria, but they mitigated the effects of the infection by modulating the intestinal microbiota. A synergistic effect was observed between the FO and anticoccidials, yielding satisfactory results in substituting virginiamycin

Comparison of functional-oil blend and anticoccidial antibiotics effects on performance and microbiota of broiler chickens challenged by coccidiosis.

This study aimed to compare the effects of different levels of cashew nutshell liquid (CNSL) and castor oil (CNSL-castor oil) with growth-promoting antibiotics associated with anticoccidials in broiler chickens challenged with coccidiosis. In this work, 2520 one-day-old male broiler chicks (Cobb) were randomly assigned to 84 pens, containing 30 birds each. The experimental design was completely randomized, with seven treatments: enramycin (8 ppm), virginiamycin (16.5 ppm), and tylosin (55 ppm); different doses of CNSL-castor oil (0.5, 0.75, and 1.00 kg/t); and a control diet (without additives). All treatments received semduramicin + nicarbazin (500 g/t; Aviax® Plus) from 0 to 28 d and monensin sodium (100 ppm; Elanco) from 29 to 35 days of age, when the feed was without antibiotics. The challenge was introduced at 14 days of age by inoculating broiler chickens with sporulated Eimeria tenella, Eimeria acervulina, and Eimeria maxima oocysts via oral gavage. In addition to performance parameters, intestinal contents were collected at 28 and 42 days of age for microbiota analysis by sequencing the 16s rRNA in V3 and V4 regions using the Illumina MiSeq platform. Taxonomy was assigned using the SILVA database (v. 138) with QIIME2 software (v. 2020.11). After one week of challenge, the broilers that received tylosin had a higher body weight gain (BWG) than those in the control group (p < 0.05), while the other treatments presented intermediate values. At 28 d, the BWG was lower for the control, CNSL-Castor oil 0.5 kg/t, enramycin, and virginiamycin treatments than that in the tylosin treatment. The inclusion of CNSL-Castor oil at concentrations of 0.75 and 1 kg/t acted as an intermediate treatment (p < 0.05). For alpha diversity, using the Shannon index, it was possible to observe the effect of age, with substantial diversity at 42 d. The Firmicutes phylum had the highest abundance, with values between 84.33% and 95.16% at 42 d. Tylosin showed better performance indices than other treatments. CNSL-castor oil treatments with concentrations of 0.75 and 1 kg/t showed similar results to those of enramycin and virginiamycin. Furthermore, CNSL-castor oil acted as a modulator of intestinal microbiota, reducing the abundance of pathogenic bacteria

Table1_AnnotaPipeline: An integrated tool to annotate eukaryotic proteins using multi-omics data.XLSX

Assignment of gene function has been a crucial, laborious, and time-consuming step in genomics. Due to a variety of sequencing platforms that generates increasing amounts of data, manual annotation is no longer feasible. Thus, the need for an integrated, automated pipeline allowing the use of experimental data towards validation of in silico prediction of gene function is of utmost relevance. Here, we present a computational workflow named AnnotaPipeline that integrates distinct software and data types on a proteogenomic approach to annotate and validate predicted features in genomic sequences. Based on FASTA (i) nucleotide or (ii) protein sequences or (iii) structural annotation files (GFF3), users can input FASTQ RNA-seq data, MS/MS data from mzXML or similar formats, as the pipeline uses both transcriptomic and proteomic information to corroborate annotations and validate gene prediction, providing transcription and expression evidence for functional annotation. Reannotation of the available Arabidopsis thaliana, Caenorhabditis elegans, Candida albicans, Trypanosoma cruzi, and Trypanosoma rangeli genomes was performed using the AnnotaPipeline, resulting in a higher proportion of annotated proteins and a reduced proportion of hypothetical proteins when compared to the annotations publicly available for these organisms. AnnotaPipeline is a Unix-based pipeline developed using Python and is available at: https://github.com/bioinformatics-ufsc/AnnotaPipeline.</p

Table2_AnnotaPipeline: An integrated tool to annotate eukaryotic proteins using multi-omics data.docx

Assignment of gene function has been a crucial, laborious, and time-consuming step in genomics. Due to a variety of sequencing platforms that generates increasing amounts of data, manual annotation is no longer feasible. Thus, the need for an integrated, automated pipeline allowing the use of experimental data towards validation of in silico prediction of gene function is of utmost relevance. Here, we present a computational workflow named AnnotaPipeline that integrates distinct software and data types on a proteogenomic approach to annotate and validate predicted features in genomic sequences. Based on FASTA (i) nucleotide or (ii) protein sequences or (iii) structural annotation files (GFF3), users can input FASTQ RNA-seq data, MS/MS data from mzXML or similar formats, as the pipeline uses both transcriptomic and proteomic information to corroborate annotations and validate gene prediction, providing transcription and expression evidence for functional annotation. Reannotation of the available Arabidopsis thaliana, Caenorhabditis elegans, Candida albicans, Trypanosoma cruzi, and Trypanosoma rangeli genomes was performed using the AnnotaPipeline, resulting in a higher proportion of annotated proteins and a reduced proportion of hypothetical proteins when compared to the annotations publicly available for these organisms. AnnotaPipeline is a Unix-based pipeline developed using Python and is available at: https://github.com/bioinformatics-ufsc/AnnotaPipeline.</p

Genomic Surveillance of SARS-CoV-2 in Healthcare Workers: A Critical Sentinel Group for Monitoring the SARS-CoV-2 Variant Shift

SARS-CoV-2 genome surveillance is important for monitoring risk groups and health workers as well as data on new cases and mortality rate due to COVID-19. We characterized the circulation of SARS-CoV-2 variants from May 2021 to April 2022 in the state of Santa Catarina, southern Brazil, and evaluated the similarity between variants present in the population and healthcare workers (HCW). A total of 5291 sequenced genomes demonstrated the circulation of 55 strains and four variants of concern (Alpha, Delta, Gamma and Omicron—sublineages BA.1 and BA.2). The number of cases was relatively low in May 2021, but the number of deaths was higher with the Gamma variant. There was a significant increase in both numbers between December 2021 and February 2022, peaking in mid-January 2022, when the Omicron variant dominated. After May 2021, two distinct variant groups (Delta and Omicron) were observed, equally distributed among the five Santa Catarina mesoregions. Moreover, from November 2021 to February 2022, similar variant profiles between HCW and the general population were observed, and a quicker shift from Delta to Omicron in HCW than in the general population. This demonstrates the importance of HCW as a sentinel group for monitoring disease trends in the general population

Emergence of Two Distinct SARS-CoV-2 Gamma Variants and the Rapid Spread of P.1-like-II SARS-CoV-2 during the Second Wave of COVID-19 in Santa Catarina, Southern Brazil

The western mesoregion of the state of Santa Catarina (SC), Southern Brazil, was heavily affected as a whole by the COVID-19 pandemic in early 2021. This study aimed to evaluate the dynamics of the SARS-CoV-2 virus spreading patterns in the SC state from March 2020 to April 2021 using genomic surveillance. During this period, there were 23 distinct variants, including Beta and Gamma, among which the Gamma and related lineages were predominant in the second pandemic wave within SC. A regionalization of P.1-like-II in the Western SC region was observed, concomitant to the increase in cases, mortality, and the case fatality rate (CFR) index. This is the first evidence of the regionalization of the SARS-CoV-2 transmission in SC and it highlights the importance of tracking the variants, dispersion, and impact of SARS-CoV-2 on the public health systems