A role of efflux pumps in intrinsic drug resistance and virulence of Mycobacterium tuberculosis

Las bombas de eflujo son proteínas de membrana que transportan distintos compuestos al exterior de la bacteria. Se ha descrito que están implicadas en resistencia intrínseca y adquirida a varios antibióticos, así como en colonización y persistencia de bacterias patógenas en el hospedador. Además, diversos procesos fisiológicos pueden verse afectados por estas proteínas de membrana, con dependencia de cuál sea el sustrato natural de la bomba de eflujo. En la actualidad, las cepas de Mycobacterium tuberculosis resistentes a antibióticos suponen un grave problema de salud. No sólo se han descrito cepas multi y extremadamente resistentes, si no también resistentes a todos los antibióticos testados. Por ello es necesario un esfuerzo a nivel global que permita controlar esta situación de emergencia. Algunas de las estrategias seguidas son: el desarrollo de nuevos antibióticos contra la tuberculosis y el programa DOTS (Directly Observed Treatment Short Course) de la OMS. Un mejor conocimiento de los mecanismos de resistencia a antibióticos nos proporcionaría buenas herramientas para mejorar el tratamiento anti-tuberculosis. Las bombas de eflujo MFS Rv1258c (Tap), Rv2333 (Stp) y Rv1410c (P55) de M. tuberculosis se habían estudiado previamente en el organismo heterólogo M. bovis BCG, la cepa vacunal. Se observó como resultado que éstas estaban implicadas en la resistencia intrínseca a varios compuestos. Aunque el modelo de M. bovis BCG es una buena aproximación, debido al alto porcentaje de identidad entre M. tuberculosis y M. bovis BCG, las diferencias en el fondo genético pueden afectar a la función de estos transportadores, y el carácter no-virulento de la cepa BCG impide el estudio de la implicación de estas bombas de eflujo en la virulencia de M. tuberculosis. Por ello, nuestro objetivo principal fue estudiar estas tres bombas de eflujo (Tap, Stp y P55) en el microorganismo del que provienen, M. tuberculosis. Se construyeron, derivadas la cepa de referencia M. tuberculosis H37Rv, mutantes knock-out para cada una de las bombas, así como sus respectivas complementadas, además de las cepas que sobreexpresan el gen de la bomba de eflujo. Los ensayos de sensibilidad a antibióticos realizados con estas cepas confirmaron la mayoría, aunque no todos, de los resultados en M. bovis BCG. Además, se llevaron a cabo experimentos de infección en modelo celular y de ratón, para comprobar si la deleción del gen de la correspondiente bomba de eflujo afectaba a la virulencia de M. tuberculosis. Atendiendo al modelo celular, las tres bombas de eflujo parecían ser necesarias para la virulencia completa de H37Rv; sin embargo, en modelo de ratón inmunocompetente, solamente el mutante knock-out de P55 resultó ser atenuado. En búsqueda de otra estrategia para detectar posibles sustratos de bombas de eflujo de M. tuberculosis, decidimos intentar expresarlas en Escherichia coli. Además de los ensayos de Concentración Inhibitoria Mínima, se realizaron varios ensayos que permiten visualizar la acumulación y el eflujo de compuestos el tiempo real. En caso de éxito, esta técnica permitiría comprobar rápida y fácilmente una batería de sustratos potenciales de la bomba de eflujo. Desafortunadamente, no se obtuvieron resultados significativos; es necesario continuar con varios experimentos para confirmar la expresión de las bombas de eflujo micobacterianas en E. coli. En paralelo, caracterizamos el fenotipo de dos cepas de M. tuberculosis mutantes knock-out para las bombas de eflujo MmpL7 y MmpL10. La cepa con el gen mmpL7 delecionado resultó tener una velocidad de crecimiento mayor, y formaba menos agregados al cultivarse en medio líquido que su respectiva cepa wild-type. Finalmente, se realizó un análisis de cepas clínicas de M. tuberculosis resistentes a estreptomicina. Se secuenciaron los tres genes relacionados con resistencia a estreptomicina (rpsL, rrs y gidB) en búsqueda de posibles mutaciones. Un cuarto gen se incluyó en el experimento: Rv1258c, que codifica la bomba de eflujo Tap, y que previamente se había descrito que está implicado en la resistencia a estreptomicina. Nuestra hipótesis era que una posible mutación en el promotor o en el gen podría conferir resistencia a este antibiótico. Aunque no encontramos ninguna mutación en el gen Rv1258c que cumpliera este criterio, sí que descubrimos una mutación que estaba presente en varias cepas. El análisis en detalle reveló que este SNP (Single Nucleotide Polymorphism), denominado Tap580, era específico de las cepas de la familia Beijing. Se diseño un método PCR-RFLP que permite detectar fácil y rápidamente esta mutación, y posteriormente se validó con un lote de 220 DNA de aislados clínicos pertenecientes a diferentes familias de M. tuberculosis