Mitochondrie v biodozimetrii: Hodnocení průtokovou cytometrií in vitro

The JC-1 dye is widely used in apoptosis studies to monitor mitochondrial health. The probe was tested in vitro on two established cell lines and peripheral porcine blood lymphocytes after gamma irradiation (IR) to assess its potential in biodosimetric evaluation. In brief, we stained irradiated and non-irradiated cells with the JC-1 dye to determine the existing changes in mitochondrial membrane potential and monitor cell health through flow cytometry. The stage of injury in these cells was evaluated through an irradiated versus non-irradiated ratio (IVNIR), comparing the relative proportion of polarised cells containing red JC-1 aggregates. We observed a decreasing IVNIR as the radiation dose increased (i.e. 0.5; 1; 2; 4; 6; 8 and 10 Gy), performing the analysis at 4, 8 and 24 h after IR in all the tested cells. The results from the JC1-dye test showed that CD4 T lymphocytes were more sensitive to irradiation than other subpopulations.Barvivo JC-1 se široce používá ve studiích apoptózy ke sledování stavu mitochondrií. Sonda byla testována in vitro na dvou zavedených buněčných liniích a na lymfocytech z periferní prasečí krve po ozáření gama zářením (IR), aby se posoudil její potenciál při biodozimetrickém hodnocení. Stručně řečeno, ozařované a neozářené buňky jsme obarvili barvivem JC-1, abychom určili existující změny mitochondriálního membránového potenciálu a sledovali zdraví buněk pomocí průtokové cytometrie. Stupeň poškození těchto buněk byl vyhodnocen pomocí poměru ozářených a neozářených buněk (IVNIR), přičemž byl porovnán relativní podíl polarizovaných buněk obsahujících červené agregáty JC-1. Pozorovali jsme klesající IVNIR se zvyšující se dávkou záření (tj. 0,5; 1; 2; 4; 6; 8 a 10 Gy), přičemž analýzu jsme provedli po 4, 8 a 24 hodinách po IR u všech testovaných buněk. Výsledky testu s barvivem JC1 ukázaly, že lymfocyty CD4 T byly citlivější na ozáření než ostatní subpopulace

Changes in phosphorylation of histone H2A.X and p53 in response of peripheral blood lymphocytes to gamma irradiation

The main aim of this study was to compare the reaction of quiescent and proliferating, i.e. phytohemagglutinin (PHA)-stimulated, human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) to γ-radiation, and analyse changes of proteins related to repair of DNA damage and apoptosis, such as γH2A.X, p53, p53 phosphorylation at serines-15 and -392, and p21 and their dose dependence. Freshly isolated PBMCs in peripheral blood are predominantly quiescent, in G0 phase, and with very low amounts of proteins p53 and p21. Using confocal microscopy we detected dose dependent (0.5-5 Gy) induction of foci containing γH2A.X (1 h after γ-ray exposure), which are formed around radiation-induced double strand breaks of DNA. Apoptosis was detected from 24 h after irradiation by the dose of 4 Gy onwards by Annexin V binding and lamin B cleavage. Seventy two hours after irradiation 70% of CD3+ lymphocytes were A+. Neither increase in p53 nor its phosphorylation on serine-392 after irradiation was detected in these cells. However, massive increase in p21 (cyclin-dependent kinase inhibitor 1A) was detected after irradiation, which can be responsible for late occurrence of apoptosis in these quiescent cells. PHA-stimulation itself (72 h) caused an increase in early apoptosis (A+PI-) in comparison to non-stimulated PBMCs (38% A+ resp. 13.4%). After PHA-stimulation also the amount of γH2A.X, p53, and p21 increased, but no phosphorylation of p53 on serine-392 or -15 was detected. Reaction to γ-radiation was different in PHA-stimulated lymphocytes: the p53 pathway was activated and p53 was phosphorylated on serines-15 and -392 4 h after irradiation by the dose of 4 Gy. Phosphorylation of p53 at serine-15 increased in a dose-dependent manner in the studied dose range 0.2-7.5 Gy. Also the amount of p21 increased after irradiation. Seventy two hours after irradiation of PHA-stimulated CD3+ T lymphocytes by the dose of 4 Gy 65% of cells were A+

Radioterapie na oblast lůžka tumoru u žen, které podstoupily prs zachovávající chirurgický výkon pro karcinom prsu – bezpečnostní lem s nebo bez řízení obrazem

Image guided radiation therapy (IGRT) enables the achievement of higher precision in radiation delivery, a reduction in safety margins and a reduced risk of toxicity in healthy tissues. The present study investigated the magnitude of safety margins for the radiation boost setup on skin marks or metal clips implanted into the tumor bed during breast cancer surgery. One hundred eighty-four patients after breast conserving surgery with implanted metal clips into tumor bed were analyzed. The present study investigated the difference in safety margin required for the treatment setup on skin marks and metal clips. The skin marks were created using a positioning laser system in the treatment room. Metal clips implanted in the tumor bed were registered using IGRT with kilovoltage X-rays in orthogonal projection. Treatment setup was performed during free breathing. The safety margin corresponding to the planning target volume (PTV) was calculated from the recorded data. Calculated safety margins for the treatment setup on skin marks were 9.4, 11.1 and 11.1 mm in the anteroposterior, craniocaudal, and laterolateral directions, respectively. Corresponding safety margins with the use of IGRT and metal clips registration were 4.7, 5.1 and 5.9 mm, respectively. The safe PTV margin was 12 mm using setup on skin marks without IGRT, whereas a 6-mm margin was sufficient with the use of metal clip-based IGRT with daily online correction. IGRT has been adopted as the standard treatment method within the Oncology Centre of Multiscan and Pardubice Hospital (Pardubice, Czech Republic).Radioterapie řízená obrazem (IGRT) umožňuje dosáhnout vysoké přesnosti při aplikaci léčby zářením, dovoluje redukci velikosti bezpečnostních lemů a snižuje rizika toxicity v oblasti zdravých tkání. Naše studie zkoumala potřebnou velikost bezpečnostních lemů při použití redukovaných polí na lůžko tumoru, pokud je použito značek na kůži nebo kovových markerů implantovaných při chirurgickém výkonu. Bylo hodnoceno 184 nemocných po prs zachovávajícím výkonu, které měly zavedeny kovové markery do lůžka tumoru. Byl hodnocen rozdíl ve velikosti bezpečnostního lemu, který je nezbytný pro léčbu za použití značek na kůži oproti léčbě se zaměřením na kovové markery. Zaměření na kožní značky bylo provedeno v ozařovací místnosti pomocí pozičního laserového systému. Kovové klipy implantované do tumoru byly registrovány za použití IGRT pomocí RTG snímků v orthogonální projekci. Zaměření nemocného bylo provedeno v průběhu volného dýchání. Bezpečnostní lem pro určení plánovacího cíleného objemu (PTV) byl vypočten ze změřených hodnot při korekci nastavení. Při zaměření na kožní značky byly jeho rozměry 9.4, 11.1 a 11.1 mm v anteroposteriorním, kraniokaudálním a laterolaterálním směru. Korespondující bezpečnostní lemy při použití IGRT a kovových markerů byly 4.7, 5.1 a 5.9 mm. Pro klinickou praxi je považován za vhodný bezpečnostní lem o velikosti 12 mm bez IGRT a při použití IGRT a kovových markerů pro denní online korekci nastavení nemocné považujeme za dostatečný lem 6 mm. IGRT bylo zařazeno do standardních postupů v Onkologickém centru Multiscan a Nemocnice Pardubice (Pardubice, Česká republika)