Glutamiini Drosophila melanogasterin suolen kantasolujen säätelyssä

Nisäkkäiden ohutsuolta vastaavan Drosophilan keskisuolen kantasolut ovat sen ainoina jakautuvina soluina vastuussa epiteelin solujen täydentämisestä, niin reaktiona vaurioitumiseen kuin normaaliin soluvaihtuvuuteen. Kantasolujen aktivoitumisen säätelymekanismit ja niistä johtuva proliferaatio ovat monimutkaisia, sekä edelleen tutkimuksen kohteina. Keskisuoli myös reagoi voimakkaasti ruoan ravintoaineisiin, ja tarkkaan kontrolloiduilla tutkimusasetelmilla kyetään selvittämään miten yksittäinen ravintoaine vaikuttaa kantasolujen toimintaan. Mikäli vaikutus löydetään, kyseisen ravintoaineen metaboliareittien tutkimus saattaa antaa uutta tietoa keskisuolen ja kantasolujen säätelystä. On todettu, että aminohappo glutamiini voi parenteraaliseen ruokinnan lisänä ehkäistä suolistoesteen surkastumista, lisätä kriittisesti sairaiden potilaiden selviytymistä, sekä pidentää aikaa, jolloin potilasta voidaan pitää ruokinnassa. Glutamiini on suoliston soluille tärkeä energian lähde, joka toimii myös hiilen lähteenä sitruunahappokierrossa ja elinten välisenä typenkuljettajana. Lisäksi glutamiini on myös osallisena proteiinien sekä nukleotidien synteesissä. Tutkielmassa tarkastellaan glutamiinilisän vaikutusta keskisuolen solupopulaatioihin sekä niiden ominaisuuksiin konfokaalimikroskopian ja tietokonelaskennan keinoin. Mikroskopiaa varten perustettiin Gal4/UAS-järjestelmään pohjautuva sukujuurijäljitys risteyttämällä kaksi Drosophila-kantaa, sekä leimattiin kaksi solutyyppiä fluoresoivilla aineilla. Kuvat analysoitiin ensin Imaris-ohjelmalla ja sen jälkeen tutkielmaa varten kehitetyllä analyysimetodilla, joka mahdollistaa keskisuolen eri alueiden kokonaisvaltaisen tarkastelun. Aiemmat ravintoainesäätelyä tarkastelleet tutkimukset ovat pääasiallisesti keskittyneet vain tiettyihin keskisuolen osa-alueisiin, mistä johtuen kokonaiskuva säätelystä on voinut jäädä vajavaiseksi. Valmistunutta “Longitudinal Analysis of Midgut”-menetelmää (LAM) voidaan jatkossa hyödyntää uusien ravintoaineiden ja muiden suolen soluihin vaikuttavien tekijöiden tutkimiseen. Glutamiinilisän havaittiin kasvattavan keskisuolten kokonaissolumääriä lähes samalle tasolle kuin eläimillä, joita oli ruokittu kaikkia tarpeellisia ravintoaineita sisältävällä dieetillä. Sukujuurileimattujen solujen havaittiin lisääntyvän pääasiassa R3- ja R4-alueilla. Suurin solumäärien kasvu havaittiin enteroendokriinisoluilla posterioorisessa R3:ssa, mutta merkittävää kasvua oli lähes koko keskisuolen alueella. Ravinnon huomattiin myös muuttavan keskisuolen eri osien mittasuhteita: anterioorinen puoli lyheni ja posterioorinen pidentyi. Viitteitä löytyi myös endoreplikaation aktivoitumisesta enterosyyteissä. Tutkielman aikana muodostunut analyysiprotokolla sekä uusi tietokonelaskennallinen menetelmä mahdollistavat tulevaisuudessa nopeamman ravintoaineiden vaikutuksien tutkimuksen keskisuolessa. Menetelmä on myös hyödynnettävissä monenlaisiin muihin tutkimuksiin jotka vaikuttavat suoliston solukantoihin.The intestinal stem cells (ISC) are responsible for the regeneration of the intestine epithelial barrier after acute injury and for the replenishment of its cells overall. How the ISC activation and resulting proliferation is controlled is complex and still under study. The ISCs of the midgut, which is the functional analogue to mammalian small intestine, are also highly responsive to changes in nutrition, and with proper methodologies it is possible to study the effects of diet on stem cell activation. The metabolic flux of the nutritional components of the diet can then shed light on which metabolic pathways are necessary for nutrient-dependent proliferation. One nutrient that has garnered interest is glutamine (Gln). It is well established that glutamine supplementation can in parenterally fed patients diminish intestinal barrier atrophy, extend the time the patient can be kept under the regime, and increase survivability of critically ill patients. Consequently, glutamine or its downstream metabolites may have stem cell activating characteristics. However, the exact regulatory mechanisms and specific effects of Gln are not well known, and studies have found contradictory results on the beneficial effects of Gln supplementation. Glutamine itself is a conditionally essential amino acid that has a variety of functions: it is an important source of nitrogen and cellular energy and contributes carbon into the tricarboxylic acid cycle (TCA) and is involved in protein and nucleotide synthesis. In this thesis, the effects of Gln supplementation on the cell populations of D. melanogaster were studied via microscopy and computational analysis. Cross-breeds of fruit fly were established to lineage label the ISC with a GAL4/UAS driver system. Confocal microscope was used to image the midguts which were then analysed with Imaris software. A novel analysis method was developed to study population changes and varying features of the cells in the midgut in an unprecedented region-by-region bulk analysis. Earlier studies into nutrient control of ISC have had limited focus within the midgut and might have consequently given a restricted view of ISC activation. This new Longitudinal Analysis of Midgut (LAM) can be utilized in a diverse set of further studies to describe conditional variation within midgut, and possibly other tissues. Gln was found to increase total cell numbers to comparable levels with well-fed midguts, and to drive limited endoreplication in enterocytes. Lineage labelled cell population grew primarily in the R3 and R4 regions of the midgut. Additionally, enteroendocrine cells (EE) were greatly increased in the posterior part of R3 but had conceivable minor increases along the whole length of the midgut. Improved nutrition was also found to affect the proportions of the midgut, presenting itself as elongated posterior and stunted anterior. Overall, the pipeline and analysis method established during this study enable more expeditious research of effects of other nutritional components and allows for study of effects of other mechanisms, for example how gene knock-downs or altered gene activities affect cell populations of the midgut