Investigation of migration and spreading of cells expressing modified talin1 forms

Fokaaliadheesiot (FA) ovat suuria, useiden proteiinien muodostamia komplekseja. Solut käyttävät adheesioita vuorovaikuttaakseen ympäristönsä sekä muiden solujen kanssa ja niiden avulla solut pystyvät mm. liikkumaan. Yksi tärkeistä proteiineista, joka osallistuu adheesioiden muodostamiseen ja ylläpitämiseen on taliini. Taliini muodostaa yhteyden solun pinnalla olevan integriinin ja solun sisällä olevan aktiinitukirangan välille. Tämä mahdollistaa solun vasteen ulkopuolella tapahtuvaan mekaaniseen muutokseen. Useat FA-proteiinit on tunnettu jo pitkään, mutta niiden ominaisuuksista ja tehtävistä soluissa on vielä puutteellisesti tietoa. Tässä työssä tutkittiin erilaisten lyhennettyjen taliini1 -muotojen vaikutusta solujen migraatioon ja leviämiseen. Tätä ennen täytyi kuitenkin optimoida ja pystyttää laitteisto migraatiokoetta varten. Optimointivaiheessa käytettiin kolmea eri solulinjaa; villityypin hiiren alkion fibroblasteja (WT MEF) sekä soluja, joista on poistettu taliini1:ä tai vinkuliinia koodaava geeni. Varsinaisessa migraatio- ja leviämiskokeissa käytettiin hiiren alkion fibroblasti -soluja, jotka eivät ekspressoi taliini1:ä, joten niihin pystyttiin transfektoimaan haluttua taliini1 -plasmidia; täyspitkää taliin1:ä (FL Tal1) tai neljää erilaista lyhennettyä taliini1 muotoa. Kaikki taliiniptoteiinit ekspressoitiin fuusioituna punaiseen fluoresoivaan proteiiniin (mCherry), joten fluoresenssimikroskoopilla oli mahdollista saada näkyviin, mitkä solut olivat alkaneet ekspressoimaan transfektoitua plasmidia. Mikroskooppikuvia analysoimalla saatiin varsinaisesti määritettyä ja laskettua kyseisten plasmidien vaikutusta migraatioon ja solujen leviämiseen. Solujen kasvualustana käytettiin peitinlaseja päällystettynä fibronektiinillä, jotta saatiin luotua tunnettu ja hallittu alusta. Kokeiden avulla pystyttiin havaitsemaan kuinka FL Tal1:ä ekspressoivat solut migroituvat ja leviävät hieman nopeammin kuin muita taliini1 muotoja ekspressoivat solut. Minitaliini4 -soluilla puolestaan havaittiin olevan hitain migroituminen ja heikoin leviäminen muihin muokattuihin taliini1 proteiineihin verrattuna. Kokeissa määritetyt ja optimoidut laitteistot sekä olosuhteet antavat hyvän alustan jatkotutkimuksiin fokaaliadheesioproteiinien parissa

In Vitro Maturation and Functionality Assessment of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelium for Therapeutic Applications

Näkökyky on ihmisen hyvinvoinnin ja elämän laadun kannalta tärkein aistimme. Näkökykyä ylläpitää verkkokalvon pigmenttiepiteeli (engl. retinal pigment epithelium, RPE), joka sijaitsee silmän takaosassa verkkokalvon ja suonikalvon välissä huolehtien erityisesti verkkokalvon näköaistinsolujen toiminnasta ja täten koko näköaistista. RPE:n toimintahäiriöt voivat johtaa verkkokalvon rappeumasairauksiin kuten ikärappeumaan, joihin liittyy heikentynyt näkökyky tai jopa sokeus. Tällä hetkellä hoitokeinot ikärappeumaan ovat varsin rajalliset. Solusiirtohoitoa, jossa vaurioituneet RPE-solut korvataan terveillä RPE-soluilla, pidetään potentiaalisena tulevaisuuden hoitokeinona verkkokalvon rappeumasairauksiin. Ihmisen alkion kantasoluista erilaistetut RPE-solut (hESC- RPE) ovat osoittautuneet lupaavaksi solulähteeksi näihin soluterapiahoitoihin. Nykyiset kliiniset kokeet ovat osoittaneet hoitojen turvallisuuden, mutta hoitojen tehokkuuden saavuttamiseksi tarvitaan vielä lisää tutkimusta sekä lisätietoa siirrettävien solujen kypsyystasojen vaikutuksesta hoitotuloksiin. Tässä väitöskirjassa keskityttiin laboratoriossa kasvatettujen hESC-RPE-solujen ominaisuuksien analysointiin kolmella eri lähestymistavalla: I) tutkittiin kasvatusalustassa käytetyn proteiinipinnoitteen vaikutusta solujen ominaisuuksiin ja RPE:lle tyypillisten proteiinien ilmentymiseen, II) tutkittiin kasvatusajan vaikutusta solujen kykyyn sietää solustressiä ja III) tutkittiin Ca2+ -kanavien ilmentymistä ja roolia hESC-RPE:ssä. Työn tulokset voidaan tiivistää kolmeen päätulokseen. Ensinnäkin, kasvatusalustana käytettävällä proteiinipinnoitteella huomattiin olevan merkittävä rooli hESC-RPE:n ominaisuuksiin. Solujen toiminnallisuus parani ja solukerroksesta tuli tasalaatuisempi. Toiseksi, pidemmällä viljelyajalla huomattiin olevan positiivisia vaikutuksia solujen kykyyn sietää paremmin solustressiä, jolla on tärkeä merkitys esimerkiksi solusiirtohoidon onnistumisen kannalta. Kolmanneksi, tutkimustulokset myös osoittivat, että Ca2+-kanavan, erityisesti jänniteohjatun CaV1.3 alatyypin, sijainti hESC-RPE-soluissa muuttui viljelyajan pidentyessä. Lisäksi osoitimme CaV1.3- kanavan osallistuvan hESC-RPE-solujen fagosytoosiin sekä verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF) erityksen säätelyyn. Yhteenvetona tämä väitöskirja tuo merkittävästi uutta tietoa hESC-RPE-solujen ominaisuuksista, joihin pystytään vaikuttumaan viljelyolosuhteilla kasvatusalustan pinnoitteella sekä viljelyajalla. Työn tuloksia voidaan hyödyntää RPE-solututkimuksissa, mutta myös soluterapiahoidon kehityksessä.Vision can be regarded as a critical sense in everyday life, and vision loss is associated with a deterioration in quality of life. The visual function is partly ensured by the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of pigmented cells supporting the welfare of the neural retina, which itself has many essential functions. Age-related macular degeneration (AMD) is a retinal degenerative disease where the degeneration of the RPE can lead to impaired or total loss of vision. To date, no curative treatment is available for AMD. However, replacement of the damaged and dysfunctional RPE cells with in vitro differentiated and cultured RPE cells is considered as a potential approach to cure AMD and other RPE degeneration- related diseases. Human embryonic stem cell-derived RPE (hESC-RPE) cells have been shown to be a promising cell source for the transplantation studies. Current clinical trials have shown no safety issues, but the efficacy of the transplantation remains to be studied in further clinical trials. One possible issue with clinical efficacy can be the immature state of the transplanted RPE cells. The work presented in this thesis focuses on the in vitro maturation of cryopreserved hESC-RPE cells with three approaches: I) to study the influence of the surface protein coating to the maturation of hESC-RPE cells on the functional level and in the expression of RPE-related proteins during maturation, II) to study the tolerance to cellular stress in different maturation levels of hESC-RPE cells, and III) to investigate the functional Ca2+ channels in hESC-RPE. Based on the results obtained in this thesis, there are three main findings. First, adding more complexity to the culture substrate protein coatings is advantageous in improving the functionality of hESC-RPE cells and producing a more homogenous RPE cell layer. Secondly, a prolonged culture time was observed to have positive effects on the ability of hESC-RPE cells to tolerate cellular stress, which is important, for example, for the success of cell transplant therapy. Thirdly, the results showed that the intracellular localization of the Ca2+ channel, in particular the voltage-gated CaV1.3 subtype, changed as the culture time increased. In addition, the results indicate that the CaV1.3 channel is involved in the regulation of phagocytosis and vascular endothelial growth factor (VEGF) secretion. To conclude, this thesis provides new insights into the phenotypic changes of cryopreserved hESC-RPE cells, which can be altered with culture conditions such as substrate protein coatings and culture time. Importantly, the results from this thesis can be utilized in RPE studies in general but also in the development of transplantation therapies

Investigation of migration and spreading of cells expressing modified talin1 forms

Fokaaliadheesiot (FA) ovat suuria, useiden proteiinien muodostamia komplekseja. Solut käyttävät adheesioita vuorovaikuttaakseen ympäristönsä sekä muiden solujen kanssa ja niiden avulla solut pystyvät mm. liikkumaan. Yksi tärkeistä proteiineista, joka osallistuu adheesioiden muodostamiseen ja ylläpitämiseen on taliini. Taliini muodostaa yhteyden solun pinnalla olevan integriinin ja solun sisällä olevan aktiinitukirangan välille. Tämä mahdollistaa solun vasteen ulkopuolella tapahtuvaan mekaaniseen muutokseen. Useat FA-proteiinit on tunnettu jo pitkään, mutta niiden ominaisuuksista ja tehtävistä soluissa on vielä puutteellisesti tietoa. Tässä työssä tutkittiin erilaisten lyhennettyjen taliini1 -muotojen vaikutusta solujen migraatioon ja leviämiseen. Tätä ennen täytyi kuitenkin optimoida ja pystyttää laitteisto migraatiokoetta varten. Optimointivaiheessa käytettiin kolmea eri solulinjaa; villityypin hiiren alkion fibroblasteja (WT MEF) sekä soluja, joista on poistettu taliini1:ä tai vinkuliinia koodaava geeni. Varsinaisessa migraatio- ja leviämiskokeissa käytettiin hiiren alkion fibroblasti -soluja, jotka eivät ekspressoi taliini1:ä, joten niihin pystyttiin transfektoimaan haluttua taliini1 -plasmidia; täyspitkää taliin1:ä (FL Tal1) tai neljää erilaista lyhennettyä taliini1 muotoa. Kaikki taliiniptoteiinit ekspressoitiin fuusioituna punaiseen fluoresoivaan proteiiniin (mCherry), joten fluoresenssimikroskoopilla oli mahdollista saada näkyviin, mitkä solut olivat alkaneet ekspressoimaan transfektoitua plasmidia. Mikroskooppikuvia analysoimalla saatiin varsinaisesti määritettyä ja laskettua kyseisten plasmidien vaikutusta migraatioon ja solujen leviämiseen. Solujen kasvualustana käytettiin peitinlaseja päällystettynä fibronektiinillä, jotta saatiin luotua tunnettu ja hallittu alusta. Kokeiden avulla pystyttiin havaitsemaan kuinka FL Tal1:ä ekspressoivat solut migroituvat ja leviävät hieman nopeammin kuin muita taliini1 muotoja ekspressoivat solut. Minitaliini4 -soluilla puolestaan havaittiin olevan hitain migroituminen ja heikoin leviäminen muihin muokattuihin taliini1 proteiineihin verrattuna. Kokeissa määritetyt ja optimoidut laitteistot sekä olosuhteet antavat hyvän alustan jatkotutkimuksiin fokaaliadheesioproteiinien parissa

Corneal epithelial differentiation of human pluripotent stem cells generates ABCB5+ and ∆Np63α+ cells with limbal cell characteristics and high wound healing capacity

Background: Differentiation of functional limbal stem cells (LSCs) from human pluripotent stem cells (hPSCs) is an important objective which can provide novel treatment solutions for patients suffering from limbal stem cell deficiency (LSCD). Yet, further characterization is needed to better evaluate their immunogenicity and regenerative potential before clinical applications. Methods: Human PSCs were differentiated towards corneal fate and cryopreserved using a clinically applicable protocol. Resulting hPSC-LSC populations were examined at days 10–11 and 24–25 during differentiation as well as at passage 1 post-thaw. Expression of cornea-associated markers including PAX6, ABCG2, ∆Np63α, CK15, CK14, CK12 and ABCB5 as well as human leukocyte antigens (HLAs) was analyzed using immunofluorescence and flow cytometry. Wound healing properties of the post-thaw hPSC-LSCs were assessed via calcium imaging and scratch assay. Human and porcine tissue-derived cultured LSCs were used as controls for marker expression analysis and scratch assays at passage 1. Results: The day 24–25 and post-thaw hPSC-LSCs displayed a similar marker profile with the tissue-derived LSCs, showing abundant expression of PAX6, ∆Np63α, CK15, CK14 and ABCB5 and low expression of ABCG2. In contrast, day 10–11 hPSC-LSCs had lower expression of ABCB5 and ∆Np63α, but high expression of ABCG2. A small portion of the day 10–11 cells coexpressed ABCG2 and ABCB5. The expression of class I HLAs increased during hPSC-LSCs differentiation and was uniform in post-thaw hPSC-LSCs, however the intensity was lower in comparison to tissue-derived LSCs. The calcium imaging revealed that the post-thaw hPSC-LSCs generated a robust response towards epithelial wound healing signaling mediator ATP. Further, scratch assay revealed that post-thaw hPSC-LSCs had higher wound healing capacity in comparison to tissue-derived LSCs. Conclusions: Clinically relevant LSC-like cells can be efficiently differentiated from hPSCs. The post-thaw hPSC-LSCs possess functional potency in calcium responses towards injury associated signals and in wound closure. The developmental trajectory observed during hPSC-LSC differentiation, giving rise to ABCG2+ population and further to ABCB5+ and ∆Np63α+ cells with limbal characteristics, indicates hPSC-derived cells can be utilized as a valuable cell source for the treatment of patients afflicted corneal blindness due to LSCD. Graphical Abstract: [Figure not available: see fulltext.]publishedVersionPeer reviewe

Cell maturation influences the ability of hESC-RPE to tolerate cellular stress

Background: Transplantation of human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) is an urgently needed treatment for the cure of degenerative diseases of the retina. The transplanted cells must tolerate cellular stress caused by various sources such as retinal inflammation and regain their functions rapidly after the transplantation. We have previously shown the maturation level of the cultured human embryonic stem cell-derived RPE (hESC-RPE) cells to influence for example their calcium (Ca2+) signaling properties. Yet, no comparison of the ability of hESC-RPE at different maturity levels to tolerate cellular stress has been reported. Methods: Here, we analyzed the ability of the hESC-RPE populations with early (3 weeks) and late (12 weeks) maturation status to tolerate cellular stress caused by chemical cell stressors protease inhibitor (MG132) or hydrogen peroxide (H2O2). After the treatments, the functionality of the RPE cells was studied by transepithelial resistance, immunostainings of key RPE proteins, phagocytosis, mitochondrial membrane potential, Ca2+ signaling, and cytokine secretion. Results: The hESC-RPE population with late maturation status consistently showed improved tolerance to cellular stress in comparison to the population with early maturity. After the treatments, the early maturation status of hESC-RPE monolayer showed impaired barrier properties. The hESC-RPE with early maturity status also exhibited reduced phagocytic and Ca2+ signaling properties, especially after MG132 treatment. Conclusions: Our results suggest that due to better tolerance to cellular stress, the late maturation status of hESC-RPE population is superior compared to monolayers with early maturation status in the transplantation therapy settings.publishedVersionPeer reviewe

Functional Voltage-Gated Calcium Channels Are Present in Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelium, Stem Cells Translational Medicine

Retinal pigment epithelium (RPE) performs important functions for the maintenance of photoreceptors and vision. Malfunctions within the RPE are implicated in several retinal diseases for which transplantations of stem cell‐derived RPE are promising treatment options. Their success, however, is largely dependent on the functionality of the transplanted cells. This requires correct cellular physiology, which is highly influenced by the various ion channels of RPE, including voltage‐gated Ca2+ (CaV) channels. This study investigated the localization and functionality of CaV channels in human embryonic stem cell (hESC)‐derived RPE. Whole‐cell patch‐clamp recordings from these cells revealed slowly inactivating L‐type currents comparable to freshly isolated mouse RPE. Some hESC‐RPE cells also carried fast transient T‐type resembling currents. These findings were confirmed by immunostainings from both hESC‐ and mouse RPE that showed the presence of the L‐type Ca2+ channels CaV1.2 and CaV1.3 as well as the T‐type Ca2+ channels CaV3.1 and CaV3.2. The localization of the major subtype, CaV1.3, changed during hESC‐RPE maturation co‐localizing with pericentrin to the base of the primary cilium before reaching more homogeneous membrane localization comparable to mouse RPE. Based on functional assessment, the L‐type Ca2+ channels participated in the regulation of vascular endothelial growth factor secretion as well as in the phagocytosis of photoreceptor outer segments in hESC‐RPE. Overall, this study demonstrates that a functional machinery of voltage‐gated Ca2+ channels is present in mature hESC‐RPE, which is promising for the success of transplantation therapies.publishedVersionPeer reviewe

Crosstalk of protein clearance, inflammasome, and Ca2+ channels in retinal pigment epithelium derived from age-related macular degeneration patients

Degeneration and/or dysfunction of retinal pigment epithelium (RPE) is generally detected as the formation of intracellular and extracellular protein aggregates, called lipofuscin and drusen, respectively, in patients with age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of blindness in the elderly population. These clinical hallmarks are linked to dysfunctional protein homeostasis and inflammation and furthermore, are both regulated by changes in intracellular Ca2+ concentration. While many other cellular mechanisms have been considered in the investigations of AMD-RPE, there has been relatively little work on understanding the interactions of protein clearance, inflammation, and Ca2+ dynamics in disease pathogenesis. Here we established induced pluripotent stem cell–derived RPE from two patients with advanced AMD and from an age- and gender-matched control subject. We studied autophagy and inflammasome activation under disturbed proteostasis in these cell lines and investigated changes in their intracellular Ca2+ concentration and L-type voltage-gated Ca2+ channels. Our work demonstrated dysregulated autophagy and inflammasome activation in AMD-RPE accompanied by reduced intracellular free Ca2+ levels. Interestingly, we found currents through L-type voltage-gated Ca2+ channels to be diminished and showed these channels to be significantly localized to intracellular compartments in AMD-RPE. Taken together, the alterations in Ca2+ dynamics in AMD-RPE together with dysregulated autophagy and inflammasome activation indicate an important role for Ca2+ signaling in AMD pathogenesis, providing new avenues for the development of therapeutic approaches.Peer reviewe

Culture surface protein coatings affect the barrier properties and calcium signalling of hESC-RPE

Human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) transplantation is currently under evaluation as treatment for macular degeneration. For therapeutic applications, cryostorage during cell production is typically needed with potential consequences to cell functionality. We have previously shown that the culture substrate affects human embryonic stem cell-derived RPE (hESC-RPE) properties in fresh cultures. Here, we aimed to further identify the role of RPE basement membrane proteins type IV collagen (Col-IV), laminin (LN), and nidogen-1 in the maturation and functionality of hESC-RPE after cryopreservation. In addition to cell attachment and morphology, transepithelial electrical resistance, expression of key RPE proteins, phagocytosis capacity and Ca2+ signalling were analysed. After cryostorage, attachment of hESC-RPE on culture surfaces coated with Col-IV alone was poor. Combining Col-IV and LN with or without nidogen-1 significantly improved cell attachment and barrier properties of the epithelium. Furthermore, functional homogeneity of the hESC-RPE monolayer was enhanced in the presence of nidogen-1. Our results suggest that the choice of coating proteins for the cell culture may have implications to the functional properties of these cells after cryostorage cell banking.publishedVersionPeer reviewe