Identification des conditions optimales d'utilisation de l'ADN polymérase Vent exo- dans la technologie LMPCR

L'étude des interactions ADN-protéines et de la structure de la chromatine dans les cellules vivantes est nécessaire à la compréhension des mécanismes de l'expression génique. La technique LMPCR ("ligation mediated polymerase chain reaction") permet l'étude in vivo de ces interactions par une analyse plus réelle des événements qui se déroulent au sein même des cellules, comparativement aux études in vitro. Par contre, la qualité des résultats peut-être grandement influencée par l'ADN polymérase utilisée et nécessite donc l'optimisation de plusieurs paramètres. De ce fait, nous avons identifié les conditions optimales d'utilisation de l'ADN polymérase Thermococcus litoralis exo- (Vent exo-) dans la technique LMPCR telle que la quantité de polymérase et d'ADN. Nous avons montré que l'efficacité de Vent exo- à l'extension d'amorces et à l'amplification était similaire à celle de Pyrococcus furiosus exo- (Pfu exo-) et supérieure à Thermus aquaticus (Taq). De plus, nous avons observé que la thermostabilité de Vent exo- lui permettait de soutenir un plus grand nombre de cycles d'amplification que Taq facilitant ainsi la résolution de séquences riches en GC. D'autre part, nous avons montré que l'activité terminale transférase de Vent exo- était inhibée dans la plupart de nos conditions expérimentales et qu'il était donc possible de l'utiliser efficacement pour la production d'extrémités franches lors de l'étape d'extension d'amorces. Finalement, l'ADN polymérase Vent exo- s'avère être une alternative efficace pour les étapes d'extension d'amorces et d'amplification PCR dans la technologie LMPCR

Transcriptional regulation of the human α6 integrin gene by the transcription factor NFI during corneal wound healing

Purpose. Wound healing of the corneal epithelium is highly influenced by regulation of integrin gene expression. A recent study demonstrated that laminin (LM), a major constituent of the extracellular matrix (ECM), reduces expression of the human α6 integrin subunit gene by altering the properties of the transcription factor (TF) Sp1. In this work, a target site was identified for the TF nuclear factor I (NFI) on the human α6 gene, and its regulatory influence was characterized in corneal epithelial cells. Methods. Plasmids bearing the α6 promoter fused to the CAT gene were transfected into human (HCECs) and rabbit (RCECs) corneal epithelial cells grown on LM. The DNA-binding site for NFI in the α6 promoter was identified by DNase I footprinting. Expression and DNA binding of NFI was monitored by Western blot, RT-PCR, and electrophoretic mobility shift assays (EMSAs), and its function was investigated through RNAi and NFI overexpression assays. Results. All NFI isoforms were found to be expressed in HCECs and RCECs. Transfection analyses revealed that NFI is a repressor of α6 expression in both types of cells. LM increases expression of NFI, whereas inhibition of each NFI isoform increases promoter activity suggesting that NFI is a key repressor of α6 transcription. In addition, the negative influence of NFI appears to be potentiated by the degradation of Sp1 when cells are grown on LM. Conclusions. Repression of α6 expression therefore contributes to the final steps of corneal wound healing by both reducing proliferation and allowing attachment of the epithelium to the basal membrane

The histone H3.1 variant regulates TONSOKU-mediated DNA repair during replication

The tail of replication-dependent histone H3.1 varies from that of replication-independent H3.3 at the amino acid located at position 31 in plants and animals, but no function has been assigned to this residue to demonstrate a unique and conserved role for H3.1 during replication. Here, we show that TONSOKU (TSK/TONSL), which rescues broken replication forks, specifically interacts with H3.1 via recognition of alanine 31 by its tetratricopeptide repeat domain. Our results indicate that genomic instability in the absence of ATXR5/ATXR6-catalyzed H3K27me1 in plants depends on H3.1, TSK and DNA polymerase theta (Pol θ). Overall, this work reveals an H3.1-specific function during replication and the common strategy used in multicellular eukaryotes for regulating post-replicative chromatin maturation and TSK, which relies on histone mono-methyltransferases and reading the H3.1 variant

Régulation génique par les facteurs de transcription NFI

La régulation de l'expression des gènes est à la base de tous processus cellulaires tels que la différenciation, la migration, la réponse aux dommages, la survie et l'apoptose. La compréhension globale des mécanismes cellulaires passe donc par l'étude de la transcription. Définir les rôles, fonctions ainsi que les voies de signalisation pour chacun des facteurs de transcription d'une cellule est maintenant un incontournable dans la poursuite de la compréhension du génome humain. Les travaux de cette thèse cadrent dans cette optique en concentrant nos efforts sur la caractérisation des facteurs de transcription ± nuclear factor I ¿ (NFI). Nous démontrons, entre autre, la première preuve de liaison directe d'un répresseur au promoteur du gène p21. Cette répression exercée par les NFI est essentielle à la bonne progression du cycle cellulaire dans les cellules en prolifération, tout en permettant l'expression basale de p21. Nous avons aussi caractérisé les mécanismes de régulation des facteurs de transcription Spl, Sp3 et NFI sur le promoteur de l'intégrine α6, en présence de laminine et de la fibronectine. Nos résultats suggèrent une répression de l'expression de l'intégrine a6 par la liaison de NFI et la diminution des facteurs Spl et Sp3 en présence de laminine, pour ainsi expliquer les mécanismes de migration et prolifération cellulaire dans un modèle de cicatrisation cornéenne. Finalement, nous examinons l'étendue de la liaison des facteurs NFI dans les kératinocytes humains de peau, par une analyse globale d'immunoprécipitation de chromatine couplée aux puces à ADN îlots CpG, dans le but d'établir une meilleure compréhension des voies de signalisation dans lesquelles les facteurs de transcription NFI sont impliqués. Ces analyses permettront de mieux comprendre les mécanismes de régulation de la transcription, particulièrement en ce qui a trait à la régulation par les facteurs de transcription NF

Profit taxes and the growth of fringe firms

In this paper we examine the optimal taxation of corporate profits in a multi-period limit pricing model where a dominant firm faces expansion by a competitive fringe. The optimal policy requires tax rates to vary both intertemporally and across firm sizes, and balances the benefit of fringe growth in eroding the market power of the dominant firm and the cost of displacing the dominant firm's output with the higher cost output of the fringe. The results are relevant for assessing the policy of giving preferential tax treatment to small firms, as practised by several OECD countries.

The use of adenosine to inhibit oocyte meiotic resumption in Bos taurus during pre-IVM and its potential to improve oocyte competence

One of the major challenges of artificial reproductive technologies is to develop new methods for pro-ducing greater numbers of embryos. An oocyte fosters the ability to develop into an embryo beforeoocyte meiotic resumption. The aim of the present study was to assess the effect of adenosine (ADO), apurine nucleoside found in follicularfluid, on the inhibition of oocyte meiotic resumption and theproduction of blastocysts. The results showed the efficacy of ADO to inhibit oocyte meiotic resumption.The use of ADO (3 mM) during a pre-in vitro maturation (pre-IVM) culture period of 6 h resulted in asignificant increase (p<0.05) of blastocysts compared to control conditions with no pre-IVM cultureperiod. No effect on the percentage of cleavage was observed. The effect of adenosine on blastocyst yieldwas time- and concentration-dependent with an optimum effect at 3 mM for 6 h. Supplementing theADO pre-IVM culture medium with estradiol, follicle-stimulating hormone, progesterone, epidermalgrowth factor, insulin-like growth factor-2 or reelin did not improve the blastocyst yield. Transcriptionalanalyses of ADO-treated cumulus cells revealed that NRP1, RELN, MAN1A1, THRA and GATM were up-regulated. Finally, bioinformatic analysis identified mitochondrial function as the top canonicalpathway affected by ADO. This opens up new opportunities for further investigations