Mecanismos intracelulares e processos inflamatórios infecciosos: mecanismos de inflamação associados com corpúsculos lipídicos

-Corpúsculos lipídicos (CLs), também conhecidos como gotículas lipídicas, são organelas ricas em lipídios, presentes na maioria das células eucarióticas. Embora a presença de CLs no citoplasma tenha sido associada no passado principalmente com armazenamento de lipídios, essas organelas são atualmente reconhecidas como funcionalmente ativas e dinâmicas. Em leucócitos, a formação de CLs está associada a diversas respostas inflamatórias e infecciosas. Patógenos, como micobactérias e parasitas, desencadeiam no hospedeiro uma cascata intracelular de sinalização que leva à formação de CLs. Dentro de leucócitos ativados, CLs recém-formados atuam como plataformas para a síntese de mediadores da inflamação como a prostaglandina E2 e leucotrieno C4. Apesar do papel relevante dos CLs, muito pouco se conhece sobre a ultra-estrutura dessas organelas em células da resposta imune. Usando-se microscopia eletrônica de transmissão (MET), o presente estudo teve como objetivo investigar a formação e interações intracelulares de CLs dentro de eosinófilos humanos ativados com fator de necrose tumoral-alfa (TNF-alfa) ou interferom-gama (INF-gama), citocinas pró-inflamatórias envolvidas na resposta imune inata. Células isoladas de doadores saudáveis por seleção negativa foram processadas para MET conforme procedimento de rotina do Lab. Biologia Celular/UFJF e analisadas em microscópio eletrônico CM-10 (Zeiss). Em eosinófilos humanos, os CLs aparecem como organelas arredondadas com diâmetros variados e elétron-densas. Análise quantitativa dos CLs mostraram, pela primeira vez, que as citocinas TNF-alfa e INF-gama induzem aumento significativo do número dessas organelas (média ± SEM de 2.11 ± 0.58 CLs/secção celular no grupo controle versus 6.18 ± 0.74 para o grupo TNF-alfa e 4.85 ± 0.53 para o grupo INF-gama, n=45 células). Além disso, em resposta a essas citocinas, CLs interagem com outras organelas citoplasmáticas, principalmente com grânulos de secreção (GR) e retículo endoplasmático (RE). Ambas as citocinas induziram aumento significativo do número de interações CL-GR, caracterizadas por contato ou fusão (média ± SEM de O,77 ± 0,46 interações/secção celular no grupo controle vs 2,35 ± 0,33 para TNF-alfa e 4,11 ± 0,71 para INF-gama). Esse tipo de interação pode ser importante para mobilização dos produtos sintetizados nos CLs durante respostas inflamatórias envolvendo eosinófilos, mecanismo celular até então desconhecido. As interações CL-RE parecem relacionadas com a biogênese dos CLs, já que proteínas do RE foram anteriormente descritas dentro dos CLs. Nossos resultados demonstram que os CLs são organelas complexas, morfologicamente distintas e ativamente formadas em eosinófilos estimulados com citocinas pró-inflamatórias. Dados do presente estudo apontam os CLs como marcadores estruturais da inflamação em células da resposta imune e alvos intracelulares importantes para intervenção terapêutica em imuno-patologias

Raphidiopsis raciborskii (CYRF-01): Habilidade de secreção de vesículas extracelulares em condições de creshabilidade de secreção de vesículas extracelulares em condições de crescimento normal e em resposta a estímulos ambientais em culturacimento normal e em resposta a estímulos ambientais em cultura

Secretion of vesicles at the cell surface, collectively termed extracellular vesicles (EVs), is an important biological process of both eukaryotic and prokaryotic cells associated with functional activities and DNA transfer. This process has been demonstrated in bacteria from aquatic ecosystems, but it is still poorly characterized in cyanobacteria. In the present work, we investigated if Raphidiopsis raciborskii (CYRF-01), a globally distributed cyanobacterium species with increasing presence in freshwater environments, is able to release EVs when exposed to environmental stressors (ultraviolet radiation or co-culture with another cyanobacterium species - Microcystis aeruginosa. Non-axenic cultures of R.raciborskii (CYRF-01) were exposed to ultraviolet radiation (UVA + UVB) for 6 h period, treatment that induces structural damage to this species while co-cultures with MIRF-01 were kept for 24 h. After the incubation times, cell density and viability were analyzed, and samples were processed for transmission electron microscopy (TEM). Our ultrastructural analyses revealed that R.raciborskii constitutively releases EVs from the outer membrane during its normal growth and amplifies such ability in response to environmental stressors. Both situations induced significant formation of outer membrane vesicles (OMVs) by R.raciborskii compared to control cells. Quantitative TEM revealed an increase of 48% (UV) and 60% (interaction) in the OMV numbers. Considering all groups, the OMVs ranged in size from 20 to 300 nm in diameter, with most OMVs showing diameters between 20 and 140 nm. Additionally, molecular analysis of the cellular envelope revealed that formation of OMVs is accompanied by phosphatidylserine exposure, an event also observed in EVsecreting eukaryotic cells. Altogether, we identified for the first time that R.raciborskii has the competence to secrete OMVs and that under different stress situations the genesis of these vesicles is increased. The amplified ability of cyanobacteria to release OMVs may be associated with adaptive responses to changes in environmental conditions and interspecies cell communication.A secreção de vesículas na superfície celular, denominadas coletivamente de vesículas extracelulares (VEs), é um processo biológico importante das células eucarióticas e procarióticas associado com atividades funcionais e transferência de DNA. Esse processo tem sido demonstrado em bactérias de ecossistemas aquáticos, mas ainda é pouco estudado em cianobactérias. No presente trabalho, investigamos se Raphidiopsis raciborskii (CYRF-01), espécie de cianobactéria de distribuição global e crescente em ambientes de água doce, é capaz de liberar VEs quando cultivada em condições normais ou exposta a estressores ambientais (radiação ultravioleta ou co-cultura com outra espécie de cianobactéria - Microcystis aeruginosa - MIRF-01). Culturas não axênicas de CYRF-01 foram submetidas à radiação ultravioleta (UVA + UVB) por 6 h, tratamento que induz danos estruturais a esta espécie ou co-cultivadas com MIRF-01 por 24 h. Após incubação, a densidade e a viabilidade celular foram analisadas e as amostras processadas para microscopia eletrônica de transmissão (MET). As análises ultraestruturais revelaram que R.raciborskii libera constitutivamente VEs a partir da membrana externa (VMEs) durante crescimento normal e amplifica essa capacidade em resposta a estressores ambientais. Ambas as situações induziram formação significativa VMEs por CYRF-01, comparado aos controles. Análises quantitativas por MET mostraram aumento de 48% (UV) e 60% (interação) nos números de VMEs. Considerando todos os grupos, as VMEs variaram de 20 a 300 nm de diâmetro, com a maioria mostrando diâmetros entre 20 e 140 nm. Análise molecular do envoltório celular revelou que a liberação de VMEs envolve exposição à fosfatidilserina, evento também observado nas células eucarióticas secretoras de VEs. Em conjunto, identificamos pela primeira vez que R.raciborskii tem competência para secretar VMEs e que, sob situações de estresse, a gênese dessas vesículas é aumentada. A capacidade ampliada das cianobactérias para liberar VMEs pode estar associada com respostas adaptativas às mudanças nas condições ambientais e pode contribuir na comunicação celular interespécies.CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorFAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerai

Alterações ultraestruturais de cianobactérias (Cylindrospermopsis raciborskii e Microcystis aeruginosa) em interação interespecífica com ênfase em corpúsculos lipídicos

Cyanobacteria are photosynthetic unicellular microorganisms responsible for most of the primary production in aquatic ecosystems. In many environments, several species of cyanobacteria cause blooms and release toxins that are harmful to other communities. In many places, it is common that there is dominance of a particular species of cyanobacteria, which may be switched over seasonal periods. Thus, there is a natural interaction between different species of cyanobacteria in which we observe changes in the behavior of the same so that they can suppress their competitors and thus dominate the environment. Several studies have evaluated interactions between cyanobacteria at the population level, but few ones investigate physiological, metabolic and ultrastructural aspects of the cells during this process. Lipid bodies (LBs), also known as lipid droplets or inclusions, are organelles present in all cell types, including cyanobacteria. In eukaryotic cells, these organelles are involved in varied cellular functions such as lipid metabolism, cellular signaling, intracellular transport and inflammation. The Cell Biology at UFJF has been studying the formation and the role of LBs in mammalian cells and, more recently, in unicellular protozoan parasites. LBs are functionally active organelles, which can be rapidly formed in response to stimuli independent of the cell type involved. The occurrence and the functional role of LBs in cyanobacteria are poorly known. Previous work of our group has identified by TEM that the number of LBs within cyanobacteria changed in response to ultraviolet radiation. The presente work aimed to study the ultrastructure of cyanobacteria strains Cylindrospermopsis raciborskii (CYRF-01) and Microcystis aeruginosa (MIRF-01) in interaction for 24n and investigate whether this interaction affects the formation of CLs. Samples of the control groups (MIRF-01 and CYR-01) and interaction group (MIRF-01/CYRF-01) were collected at 0h and 24h. For analysis and quantification of LCs we used: (1) Oil Red-O staining, which enables visualization of CLs by both bright-field and fluorescence microscopy and (2) TEM,.which provides identification of morphological aspects of LBs at high resolution. In parallel, we analyzed the density and cell viability through routine quantification with a Neubauer chamber and a membrane permeability marker, respectively. The results in both light microscopy and TEM showed a significant reduction in LB numbers (p <0.001) for the two species after 24h of interaction compared with the control groups. However, it was observed a greater reduction in the number of LBs in parallel to the increase in size in CYRF-01 compared to MIRF-01. Thus, our data suggest that LCs in cyanobacteria are dynamic organelles, able to respond to environmental stresses, as in interspecific competition and with features that can go beyond just energy storage. IN addition to CLs, other organelles and structures were analyzed and quantified such as external membrane vesicles (EMVs), polyphosphate granules, carboxysomes and thylakoid membranes. These analyses demonstrated that CYRF-01 seems to be much more responsive to environmental stimuli, since just this cyanobacterium released EMVs. Furthermore, the proportion of EMVs significantly increased in C. raciborskii cells after 24h of interaction (p <0.004). In parallel, the numbers of phosphate granules reduced in response to interaction compared to the control group (p = 0.014) as well as the area occupied by thylakoids (p <0.0001). Values found in MIRF-01 were not statistically significant (p = 0.589 and p = 0.921). The interaction did not affect cell density (p = 0.811), however, cell viability analysis showed that the interaction there is a higher quantity of non-viable cells in both strains (p <0.05 in both). However, there is a greater amount of nonviable cells, in proportion in MIRF-01 (10.81 ± 3.11%) than in CYRF-01 (7.74% ± 1.47) after the interaction. Collectively, the results of this study reinforce the importance of individual analysis of factors such as interspecific interactions that interfere directly in cyanobacteria community. This kind of interaction induces changes at the cellular level in the species involved. Therefore, a better knowledge of these responses is important to understand the community dynamics of these organisms and their relationships in aquatic ecosystems.Cianobactérias são microrganismos unicelulares fotossintetizantes responsáveis pela maior parte da produção primária em ecossistemas aquáticos. Em diversos ambientes, várias espécies de cianobactérias causam florações, liberando toxinas que são nocivas para outras comunidades. Também é comum que haja dominância de uma determinada espécie de cianobactéria, podendo esta ser alternada ao longo de períodos sazonais. Dessa forma, há uma interação natural entre espécies diferentes de cianobactérias na qual se observa mudanças no comportamento das mesmas para que possam suprimir suas competidoras e assim dominar o ambiente. Diversos estudos têm avaliado interações entre cianobactérias a nível populacional, porém, poucos investigam aspectos fisiológicos, metabólicos e ultraestruturais das células durante esse processo. Corpúsculos lipídicos (CLs), também conhecidos como gotas ou inclusões lipídicas, são organelas presentes em todos os tipos celulares, incluindo cianobactérias. Em células eucarióticas, estas organelas estão envolvidas em várias funções celulares como metabolismo de lipídios, sinalização celular, transporte intracelular e inflamação. Estudos do grupo de Biologia Celular/UFJF vêm estudando a formação e o papel de CLs em células de mamíferos e, mais recentemente, em protozoários parasitos unicelulares. CLs mostram-se como organelas funcionalmente ativas podendo ser rapidamente formados em respostas a estímulos do meio independente do tipo celular envolvido. A ocorrência e o papel de CLs em cianobactérias são pouco conhecidos. Trabalho anterior do grupo identificou, por microscopia eletrônica de transmissão (MET), alteração no número de CLs em cianobactérias submetidas à radiação ultravioleta. O presente trabalho teve como objetivo estudar a ultraestrutura de cepas de cianobactérias, Cylindrospermopsis raciborskii (CYRF-01) e Microcystis aeruginosa (MIRF-01) em interação durante 24h e investigar se esta influencia a formação de CLs. Amostras dos grupos controles (MIRF-01 e CYR-01) e do grupo interação (MIRF-01/CYRF-01) foram coletadas no tempo 0h e 24h. Para análises e quantificação do CLs foram utilizados: (1) coloração com Oil Red-O, que possibilita a marcação e visualização de CLs tanto em microscopia de campo claro como de fluorescência e (2) MET, a qual possibilita a identificação de aspectos morfológicos em alta resolução. Em paralelo, foram analisadas a densidade e viabilidade das células, através do uso de quantificação de rotina em câmara de Neubauer e uso de marcador para permeabilidade de membrana, respectivamente. Os resultados, tanto na microscopia de luz, quanto em MET, indicaram uma redução significativa de CLs (p<0,001), nas duas espécies, após a interação de 24hs quando comparadas com os grupos controle. Porém, foi observada uma redução mais acentuada no número de CLs, em paralelo com aumento de tamanho, em CYRF-01 em relação à MIRF-01. Desta forma, nossos dados sugerem que CLs em cianobactérias são organelas dinâmicas, capazes de responder a estresses ambientais, como na competição interespecífica e com funções que podem ir além de simples armazenamento energético. Além de CLs, outras estruturas e organelas foram analisadas e quantificadas, como vesículas de membrana externa (VMEs), grânulos de polifosfato, carboxissomos e tilacoides. Estas análises demonstraram que CYRF-01 parece responder mais prontamente a estímulos do meio, pois somente ela apresentou formação de VMEs. Além disso, a proporção destas vesículas aumentou significativamente nas células de C. raciborskii no grupo interação (p<0,004). Paralelamente, também em CYRF-01, os grânulos de fosfato tiveram uma menor proporção na interação em relação ao seu controle (p=0,014), bem como uma menor porcentagem de área ocupada por tilacoides (p<0,0001). Valores esses que em MIRF-01 não foram estatisticamente significativos (p=0,589 e p=0,921). A interação não alterou a densidade celular (p=0,811), entretanto, as análises de viabilidade celular mostraram que na interação há maior quantidade de células inviáveis nas duas cepas (p<0,05 em ambas). Porém, houver maior quantidade de células inviáveis, proporcionalmente, em MIRF-01 (10,81 ± 3,11%) que em CYRF-01 (7,74 ± 1,47%), após a interação. Coletivamente, os resultados deste estudo reforçam a importância da análise individual de fatores, como interações interespecíficas, que interferem diretamente na comunidade de cianobactérias. Este tipo de interação induz alterações a nível celular nas espécies envolvidas. Portanto, o melhor entendimento dessas respostas é importante na compreensão da dinâmica da comunidade desses organismos e suas relações em ecossistemas aquáticos.FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerai

The Cyanobacterium Cylindrospermopsis raciborskii (CYRF-01) Responds to Environmental Stresses with Increased Vesiculation Detected at Single-Cell Resolution

Secretion of membrane-limited vesicles, collectively termed extracellular vesicles (EVs), is an important biological process of both eukaryotic and prokaryotic cells. This process has been observed in bacteria, but remains to be better characterized at high resolution in cyanobacteria. In the present work, we address the release of EVs by Cylindrospermopsis raciborskii (CYRF-01), a filamentous bloom-forming cyanobacterium, exposed to environmental stressors. First, non-axenic cultures of C. raciborskii (CYRF-01) were exposed to ultraviolet radiation (UVA + UVB) over a 6 h period, which is known to induce structural damage to this species. Second, C. raciborskii was co-cultured in interaction with another cyanobacterium species, Microcystis aeruginosa (MIRF-01), over a 24 h period. After the incubation times, cell density and viability were analyzed, and samples were processed for transmission electron microscopy (TEM). Our ultrastructural analyses revealed that C. raciborskii constitutively releases EVs from the outer membrane during its normal growth and amplifies such ability in response to environmental stressors. Both situations induced significant formation of outer membrane vesicles (OMVs) by C. raciborskii compared to control cells. Quantitative TEM revealed an increase of 48% (UV) and 60% (interaction) in the OMV numbers compared to control groups. Considering all groups, the OMVs ranged in size from 20 to 300 nm in diameter, with most OMVs showing diameters between 20 and 140 nm. Additionally, we detected that OMV formation is accompanied by phosphatidylserine exposure, a molecular event also observed in EV-secreting eukaryotic cells. Altogether, we identified for the first time that C. raciborskii has the competence to secrete OMVs and that under different stress situations the genesis of these vesicles is increased. The amplified ability of cyanobacteria to release OMVs may be associated with adaptive responses to changes in environmental conditions and interspecies cell communication