Epitope mapping of AMP-ADH and NAD-ADH with the aid of adiabatic fast passage nuclear Overhauser enhancement spectroscopy

Im Kontext dieser Diplomarbeit wurde eine innovative Methode für die Bestimmung der Bindungsaktivität als auch der konformationellen Charakterisierung des Bindungsepitops von Liganden in der Bindungstasche des Proteins implementiert. Die Methode bedient sich eines Analogons der klassischen 1D-NOESY-Spektroskopie, unter Zuhilfenahme eines adiabatischen Inversionspulses (Adiabatic Fast Passage). Die 1D-AFP-NOESY-Sequenz gewährleistet die Detektion des relativen Anteils an direktem und indirektem NOE Transfers, welches während der Relaxationszeit der Kernspins auftritt und determinierend ist für die Bestimmung der Konfiguration des Liganden innerhalb der Bindungskavität des Proteins. Der Anteil an direktem und indirektem NOE Magnetisierungstransfers wird charakterisiert durch die NOE Aufbaukurve während der Relaxationszeit und ist für jeden individuellen Kern im Ligandenmolekül unterschiedlich. Bei einem eindimensionalen NOESY Experiment werden üblicherweise die Protonen des Liganden detekiert. Ligandenprotonen, die sich durch einen starken indirekten NOE Transfer, dem sog. Phänomen der Spin Diffusion auszeichnen, werden sich in der Bindungstasche des Proteins auf der Berührungsfläche zwischen Protein und Ligand anordnen. Im Gegensatz dazu, werden Ligandenprotonen, die wiederum einen vergleichsweise stärkeren direkten NOE Transfer aufweisen, die Position auf der Aussenfläche der Bindungskavität des Proteins einnehmen. In einem zweiten, zum 1D-AFP-NOESY komplementären Screening-Experiment wurde das Prinzip der Sättigungs-transfer-Differenz-NMR-Spektroskopie (STD) eingesetzt und verglichen. Beide Methoden beruhen auf einer Differenzbildung zwischen Sättigungstransfer- und normalem NMR-Spektrum, und resultieren in Spektren, die nur Signale bindender Liganden enthalten. Mit diesem Experiment lässt sich das Bindungsepitop von Liganden leicht bestimmen, da mit dem Protein in direktem Kontakt stehende Ligandenreste intensivere STD-Signale liefern. Das STD-Experiment wurde als 1D-Experiment aufgesetzt, mit dem Proton, als zu detekierenden Kern. Liganden, die reversibel mit der Bindungsdomäne eines Proteins in Wechselwirkung stehen, zeigen charakteristische Relaxations- und Mobilitätsunterschiede, zu den Molekülen, die keine Affinität zum Protein aufweisen. Diese zwei ergänzenden Experimente wurden mit drei verschiedenen Protein-Ligand Komplexen durchgeführt: mit Adenosinmomophosphat (AMP) und dem aus Saccharomyces cerevisiae stammenden Enzyms, der Alkoholdehydreogenase, mit dem Coenzym Nicotinamidadenindinucleotid (NAD) und der Alkoholdehydrogenase, und schließlich mit der Vanillinsäure und dem Transporterprotein, Lipocalin (Q83). Das entscheidende Ergebnis lieferte das Vergleichsexperiment zwischen AMP/ADH und dem Komplex NAD/ADH, welches im AFP-NOESY Experiment den eindeutigen Beweis für eine identische Konformation im Bezug auf die syn/anti Isomerie des N-glykosidischen Bindungswinkels zwischen der Ribose und der Base Adenine, im AMP-ADH als auch im NAD-ADH Komplex lieferte.A novel assignment method has been employed to determine the binding activity and conformational arrangement of a small-molecule ligand present in incremental excess of a high-molecular-weight receptor. The method applied is an analogon of the classical 1D NOESY experiment, with additional use of an adiabatic inversion pulse. This Adiabatic Fast Passage NOESY (AFP-NOESY) experiment provides an accurate predication about the stereochemical configuration of the ligand molecule inside the binding pocket of the protein. The latter information is based on the NOE build-up curve resulting from the pulse sequence, which is displayed as the sum of two jointly contiguous effects, during the relaxation runtime of the nuclear spins. The two effects involve the direct and indirect NOE magnetization transfer pathway, whose relative contingent for each individual ligand proton holds information about the spherical positioning of the ligand inside the binding cavity of the protein, thus determining its binding epitope. A supplementary experiment introducing the Saturation-Transfer-Difference-Spectroscopy (STD), allows for a means of certification for the newly implemented AFP-NOESY experiment

Impact of nucleic acid self-alignment in a strong magnetic field on the interpretation of indirect spin-spin interactions

Heteronuclear and homonuclear direct (D) and indirect (J) spin-spin interactions are important sources of structural information about nucleic acids (NAs). The Hamiltonians for the D and J interactions have the same functional form; thus, the experimentally measured apparent spin-spin coupling constant corresponds to a sum of J and D. In biomolecular NMR studies, it is commonly presumed that the dipolar contributions to Js are effectively canceled due to random molecular tumbling. However, in strong magnetic fields, such as those employed for NMR analysis, the tumbling of NA fragments is anisotropic because the inherent magnetic susceptibility of NAs causes an interaction with the external magnetic field. This motional anisotropy is responsible for non-zero D contributions to Js. Here, we calculated the field-induced D contributions to 33 structurally relevant scalar coupling constants as a function of magnetic field strength, temperature and NA fragment size. We identified two classes of Js, namely 1JCH and 3JHH couplings, whose quantitative interpretation is notably biased by NA motional anisotropy. For these couplings, the magnetic field-induced dipolar contributions were found to exceed the typical experimental error in J-coupling determinations by a factor of two or more and to produce considerable over- or under-estimations of the J coupling-related torsion angles, especially at magnetic field strengths >12 T and for NA fragments longer than 12 bp. We show that if the non-zero D contributions to J are not properly accounted for, they might cause structural artifacts/bias in NA studies that use solution NMR spectroscopy