Translocation from the chloroplast stroma into the thylakoid lumen allows expression of recombinant epidermal growth factor in transplastomic tobacco plants

Chloroplast transformation has many potential advantages for the production of recombinant proteins in plants. However, it has been reported that chloroplast expression of many proteins, such as human epidermal growth factor (hEGF), results hindered by post-transcriptional mechanisms. hEGF degradation has been related to the redox potential of the stroma and protein misfolding. To solve this problem, we proposed the redirection of hEGF into the thylakoid lumen where the environment could improve disulfide bonds formation stabilizing the functional conformation of the protein. We generated transplastomic tobacco plants targeting hEGF protein to the thylakoid lumen by adding a transit peptide (Str). Following this approach, we could detect thylakoid lumen-targeted hEGF by western blotting while stromal accumulation of hEGF remained undetectable. Southern blot analysis confirmed the integration of the transgene through homologous recombination into the plastome. Northern blot analysis showed similar levels of egf transcripts in the EGF and StrEGF lines. These results suggest that higher stability of the hEGF peptide in the thylakoid lumen is the primary cause of the increased accumulation of the recombinant protein observed in StrEGF lines. They also highlight the necessity of exploring different sub-organellar destinations to improve the accumulation levels of a specific recombinant protein in plastids.Fil: Morgenfeld, Mauro Miguel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Vater, Catalina Francisca. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Alfano, Edgardo Federico. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Boccardo, Noelia Ayelen. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Bravo Almonacid, Fernando Felix. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; Argentina. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología; Argentin

Acumulación diferencial de Galectina 1 humana en plantas transplastómicas de tabaco asociada a mutaciones aminoacídicas puntuales

Las plantas transplastómicas se destacan entre otros sistemas de biorreactores por su capacidad comprobada para alcanzar niveles de acumulación de péptidos recombinantes excepcionalmente elevados (>50% de la proteína soluble total; PST) sin los requerimientos de infraestructura asociados a biorreactores celulares. Sin embargo, en algunos casos se han informado niveles bajos e incluso indetectables de expresión de proteína heteróloga, por causas pobremente comprendidas. En este marco, el objetivo de este trabajo ha sido evaluar la factibilidad de producir plantas transplastómicas de tabaco capaces de expresar Galectina 1 humana (hGal-1) analizando cambios en su acumulación asociados a mutaciones aminoacídicas puntuales. hGal-1 resulta una proteína de interés debido a su potencial terapéutico asociado a sus actividades inmunomoduladoras y antiinflamatorias ampliamente reportadas. Asimismo, presenta características bioquímicas compatibles con el sistema de expresión plastídico ya que carece de modificaciones postraduccionales impropias del cloroplasto como la glicosilación.Inicialmente, clonamos en el vector de transformación plastídico el gen LGALS1 y dos variantes (V1 y V2), desarrolladas en el laboratorio del Dr. Gabriel Rabinovich mediante modificaciones aminoacídicas puntuales. Las tres construcciones (G1, V1, V2) se utilizaron para transformar plantas de Nicotiana tabacum usando biobalística. A partir de tres eventos de recombinación homóloga independientes para cada construcción (verificados por PCR), se obtuvieron nueve líneas transplastómicas. Todas las líneas resultaron capaces de expresar la proteína de interés de acuerdo a los resultados observados mediante Western blot. En ningún caso se apreciaron diferencias en el patrón electroforético respecto al estándar de hGal-1 funcional. El posterior análisis a nivel molecular permitió confirmar la homoplastía de las nueve líneas por medio tanto de la técnica de Southern blot como por el análisis de segregación, germinando semillas en medio selectivo. La actividad transcripcional del transgén resultó corroborada por Northern blot, sin que se observen diferencias apreciables entre las nueve líneas analizadas. Mediante ELISA cuantificamos la acumulación de proteína recombinante (G1: 0,04%PST; V1: 0,01%PST; V2: 0,02%PST).Destacablemente pudimos observar que una o dos modificaciones puntuales en la secuencia aminoacídica del transgén resultaron capaces de alterar significativamente los niveles de acumulación en el estroma plastídico. Esta diferencia de acumulación radica en factores postraduccionales asociados a la estabilidad proteica en el estroma del cloroplasto dado que no se observaron diferencias en la acumulación de transcriptos asociados al transgén. Los presentes resultados podrían ayudar a comprender mejor los factores limitantes asociados a la expresión de proteínas heterólogas en cloroplastos con el objetivo de aprovechar el potencial de este sistema.Fil: Vater, Catalina Francisca. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Stupirski, Juan Carlos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Bravo Almonacid, Fernando Felix. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Rabinovich, Gabriel Adrián. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Pérez Sáez, Juan Manuel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Morgenfeld, Mauro Miguel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaXIV Simposio REDBIO Argentina: Biotecnología para un mundo en cambioCiudad Autonoma de Buenos AiresArgentinaREDBIO Argentina Asociación Civi

Human recombinant galectin-1 produced by transplantomic tabacco plants

Transplastomic plants stand out from other molecular farming platforms because of the highly efficient production of recombinant proteins(>50% of the total soluble protein). In some cases, however, low and even undetectable levels of heterologous protein expression have beenreported in this system. This fact makes it necessary to evaluate and study the expression system whenever a new protein emerges as a candidateto be produced using this platform.Fil: Vater, Catalina Francisca. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Stupirski, Juan Carlos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Bravo Almonacid, Fernando Felix. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Rabinovich, Gabriel Adrián. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Pérez Sáez, Juan Manuel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Morgenfeld, Mauro Miguel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaThe LV Annual SAIB Meeting and XIV PABMB Congress 2019SaltaArgentinaSociedad Argentina de Investigación Bioquímica y Biología MolecularPanamerican Association of Biochemestry and Molecular Biolog