Toxic properties of microsome-associated alpha-synuclein species in mouse primary neurons

α-synuclein (αS) is a small protein that self-aggregates into α-helical oligomer species and subsequently into larger insoluble amyloid fibrils that accumulate in intraneuronal inclusions during the development of Parkinson's disease. Toxicity of αS oligomers and fibrils has been long debated and more recent data are suggesting that both species can induce neurodegeneration. However while most of these data are based on differences in structure between oligomer and aggregates, often preassembled in vitro, the in vivo situation might be more complex and subcellular locations where αS species accumulate, rather than their conformation, might contribute to enhanced toxicity. In line with this observation, we have shown that αS oligomers and aggregates are associated with the endoplasmic reticulum/microsomes (ER/M) membrane in vivo and how accumulation of soluble αS oligomers at the ER/M level precedes neuronal degeneration in a mouse model of α-synucleinopathies. In this paper we took a further step, investigating the biochemical and functional features of αS species associated with the ER/M membrane. We found that by comparison with non-microsomal associated αS (P10), the ER/M-associated αS pool is a unique population of oligomers and aggregates with specific biochemical traits such as increased aggregation, N- and C-terminal truncations and phosphorylation at serine 129. Moreover, when administered to murine primary neurons, ER/M-associated αS species isolated from diseased A53T human αS transgenic mice induced neuronal changes in a time- and dose-dependent manner. In fact the addition of small amounts of ER/M-associated αS species from diseased mice to primary cultures induced the formation of beads-like structures or strings of fibrous αS aggregates along the neurites, occasionally covering the entire process or localizing at the soma level. By comparison treatment with P10 fractions from the same diseased mice resulted in the formation of scarce and small puncta only when administered at high amount. Moreover, increasing the amount of P100/M fractions obtained from diseased and, more surprisingly, from presymptomatic mice induced a significant level of neuronal death that was prevented when neurons were treated with ER/M fractions immunodepleted of αS high molecular weight (HMW) species. These data provide the first evidence of the existence of two different populations of αS HMW species in vivo, putting the spotlight on the association to ER/M membrane as a necessary step for the acquisition of αS toxic features

Sviluppo di un biosensore per monitorate aggregati di α-sinucleina in cellule viventi.

Il Parkinson è una malattia neurodegenerativa ad evoluzione lenta, ma progressiva, che compromette funzioni coinvolte nel controllo del movimento e dell’equilibrio, sfociando in sintomi quali bradicinesia, rigidità muscolare e tremore a riposo. Evidenti caratteristiche neuropatologiche della malattia sono la perdita dei neuroni dopaminergici nella sostantia nigra e la presenza di inclusioni intracellulari di α-syn, chiamati Lewy bodies. È stato osservato che mutazioni o polimorfismi del gene SNCA, codificante per α-syn, sono responsabili, rispettivamente, di forme autosomiche dominanti e forme sporadiche di Parkinson. α-syn è una proteina di 14 kDa, trovata fisiologicamente nel terminale presinaptico dei neuroni, che sembra essere coinvolta nella plasticità sinaptica. Indispensabile per il processo di aggregazione è un motivo altamente idrofobico che comprende 65-90 residui amminoacidici, presente nella regione centrale della proteina. αsyn, infatti, esiste in modo predominante in forma monomerica, ma ciò non esclude la possibilità di formare multimeri stabili e/o di adottare differenti strutture sotto specifiche condizioni di stress-inducibile o mediante interazione con altre proteine, specifici ligandi, lipidi e membrane biologiche. Nel processo di aggregazione i monomeri di a-syn formano inizialmente oligomeri o protofibrille con una forma sferica, di dimensioni variabili, ma ancora solubili; successivamente, α-syn subisce un drastico cambiamento strutturale, assumendo una conformazione a β-foglietto che si assembla in fibrille o aggregati all’interno delle cellule. Tali aggregati sono presenti sia nel citoplasma che sulla superficie del reticolo endoplasmatico. Lo scopo di questa tesi è stata la creazione di un biosensore in grado di rilevare e di seguire nel tempo l’aggregazione in cellule vive, tramite in vivo-cell imaging. Per lo sviluppo di tale biosensore ci siamo serviti della metodologia FRET che rivela la presenza di un segnale soltanto quando le due molecole fluorescenti, dette donatore ed accettore, sono ad una opportuna distanza. I biosensori per l’espressione citoplasmatica sono stati ottenuti clonando separatamente CFP e YFP, due varianti di GFP, in frame con il C-terminale di αS WT (pcDNA-αS), mentre per l’espressione nel reticolo i biosensori sono stati generati clonando separatamente CFP e YFP in frame con il C-terminale di αS nel plasmide pCMV-ER-αS, che dirige l’espressione di αS nel reticolo endoplasmatico, attraverso una sequenza di localizzazione e ritenzione. Una volta ottenuti i vari cloni, stabilità, livello di espressione e localizzazione subcellulare sono stati controllati tramite l'espressione transiente in cellule di neuroblastoma SH-SY5Y. Attraverso Western Blot ho verificato che il peso molecolare fosse quello corretto e che le proteine fossero nella porzione solubile, mentre, per mezzo della microscopia confocale, ho potuto osservare la localizzazione cellulare mediante immunofluorescenza con un marcatore per il reticolo. A questo punto, ho testato se i biosensori fossero in grado di riconoscere aggregati di αS nelle cellule, sfruttando il segnale FRET. Ho seminato le cellule SH-SY5Y su vetrini wilkoa il giorno prima e poi trasfettate con αS-CFP e αS-YFP, sia la variante citoplasmatica che del reticolo, singolarmente o in combinazione. Dopo la trasfezione le cellule sono state differenziate con acido retinoico per 24h e quindi rilevata la presenza di aggregati di αS mediante la comparsa di un segnale FRET monitorato in vivo utilizzando il microscopio confocale. Solo l’espressione dei due plasmidi insieme, C-αS-CFP e C-αS-YFP o la variante ER, produce un segnale FRET. Il passo successivo sarà quello di mettere a punto un modello cellulare stabile ed inducibile per monitorare il processo di aggregazione di αS come avviene nelle cellule viventi

Alpha-Synuclein FRET Biosensors Reveal Early Alpha-Synuclein Aggregation in the Endoplasmic Reticulum

Endoplasmic reticulum (ER) dysfunction is important for alpha-synuclein (αS) acquired toxicity. When targeted to the ER in SH-SY5Y cells, transient or stable expression of αS resulted in the formation of compact αS-positive structures in a small subpopulation of cells, resembling αS inclusions. Thus, because of the limitations of immunofluorescence, we developed a set of αS FRET biosensors (AFBs) able to track αS conformation in cells. In native conditions, expression in i36, a stable cell line for ER αS, of intermolecular AFBs, reporters in which CFP or YFP has been fused with the C-terminal of αS (αS-CFP/αS-YFP), resulted in no Förster resonance energy transfer (FRET), whereas expression of the intramolecular AFB, a probe obtained by fusing YFP and CFP with αS N- or C- termini (YFP-αS-CFP), showed a positive FRET signal. These data confirmed that αS has a predominantly globular, monomeric conformation in native conditions. Differently, under pro-aggregating conditions, the intermolecular AFB was able to sense significantly formation of αS oligomers, when AFB was expressed in the ER rather than ubiquitously, suggesting that the ER can favor changes in αS conformation when aggregation is stimulated. These results show the potential of AFBs as a new, valuable tool to track αS conformational changes in vivo