High efficiency family shuffling based on multi-step PCR and in vivo DNA recombination in yeast: statistical and functional analysis of a combinatorial library between human cytochrome P450 1A1 and 1A2

The design of a family shuffling strategy (CLERY: Combinatorial Libraries Enhanced by Recombination in Yeast) associating PCR-based and in vivo recombination and expression in yeast is described. This strategy was tested using human cytochrome P450 CYP1A1 and CYP1A2 as templates, which share 74% nucleotide sequence identity. Construction of highly shuffled libraries of mosaic structures and reduction of parental gene contamination were two major goals. Library characterization involved multiprobe hybridization on DNA macro-arrays. The statistical analysis of randomly selected clones revealed a high proportion of chimeric genes (86%) and a homogeneous representation of the parental contribution among the sequences (55.8 ± 2.5% for parental sequence 1A2). A microtiter plate screening system was designed to achieve colorimetric detection of polycyclic hydrocarbon hydroxylation by transformed yeast cells. Full sequences of five randomly picked and five functionally selected clones were analyzed. Results confirmed the shuffling efficiency and allowed calculation of the average length of sequence exchange and mutation rates. The efficient and statistically representative generation of mosaic structures by this type of family shuffling in a yeast expression system constitutes a novel and promising tool for structure–function studies and tuning enzymatic activities of multicomponent eucaryote complexes involving non-soluble enzymes

Sequence Mapping of Combinatorial Libraries on Macro- and Microarrays Bioinformatic Treatment of Data

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Producing Chimeric Genes by CLERY In Vitro and In Vivo Recombination

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Sequence Mapping of Combinatorial Libraries on Macro- or Microarrays Experimental Design of DNA Arrays

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Computational Methods for Sequence Mapping of Large Combinatorial Libraries and Deduced Sequence Signatures

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Exploration of Natural and Artificial Sequence Spaces: Towards a Functional Remodeling of Membrane-bound Cytochrome P450

International audienceTwo complementary methods are described that associate in vitro and in vivo steps to generate sequence diversity by segment directed saturated mutagenesis and family shuffling. A high-throughput DNA chip-based procedure for the characterization and potentially the equalization of combinatorial libraries is also presented. Using these approaches, two combinatorial libraries of cytochrome P450 variants derived from the CYP1A subfamily were constructed and their sequence diversity characterized. The results of functional screening using high-throughput tools for the characterization of membrane P450-catalyzed activities, suggest that the 204–214 sequence segment of human CYP1A1 is not critical for polycyclic aromatic hydrocarbon recognition, as was hypothesized from previous data. Moreover, mutations in this segment do not alter the discrimination between alkoxyresorufins, which, for all tested mutants, remained similar to that of wild-type CYP1A1. In contrast, the constructed CYP1A1–CYP1A2 mosaic structures, containing multiple crossovers, exhibit a wide range of substrate preference and regioselectivity. These mosaic structures also discriminate between closely related alkoxyresorufin substrates. These results open the way to global high-throughput analysis of structure–function relationships using combinatorial libraries of enzymes together with libraries of structurally related substrates

L’enseignement français en Méditerranée

S’appuyant sur plusieurs réseaux d’écoles, celui des congrégations catholiques puis des missions protestantes, mais également ceux de l’Alliance israélite universelle et de la Mission laïque française, la France cherche à propager un modèle, celui de la mission civilisatrice. Elle parvient ainsi à entretenir ses clientèles dans le Maghreb colonial, au Levant comme dans les marges de l’Empire ottoman. L’ouvrage interroge tout particulièrement la place des communautés juives dans le dispositif scolaire français. Accueillis dans les établissements de l’Alliance israélite, créée à la suite de l’affaire de meurtre rituel survenue à Damas en 1840, les juifs figurent également en nombre dans les autres établissements français, chrétiens comme laïques. L’antisémitisme développé en métropole et dans la société coloniale algérienne est partagé par certains missionnaires. Est-il pour autant propagé dans les écoles des missions catholiques ? Que masque le « Jewish work » revendiqué par les missionnaires protestants dans l’Empire ottoman ou en Perse ? Cet ouvrage vise à croiser les types d’archives, en premier lieu celles de l’Alliance israélite qui offrent une source remarquable à l’historien de l’éducation, afin de mettre à jour les distorsions entre les discours et les stratégies mises en œuvre au sein du réseau scolaire français. Le discours de la « régénération » morale des juifs orientaux par l’école rejoint en fin de compte celui des missionnaires envers les chrétiens d’Orient. Comme la Mission laïque française, l’Alliance israélite offre une éducation qui répond aux standards français et se veut ouverte à tous, juifs et non-juifs, chrétiens et musulmans. Elle oppose un autre modèle à l’enseignement juif traditionnel et éclaire les tensions à l’intérieur des communautés juives. Confrontée successivement à l’ottomanisme, au nationalisme arabe et au sionisme envers lequel elle est supposée hostile, l’Alliance israélite apparaîtrait donc presque comme un sujet banal de cette histoire coloniale française en Méditerranée. Ses écoles, comme celles des autres réseaux missionnaires ou laïcs, en révèlent néanmoins toutes les arcanes, pour ce qu’elles nous apprennent des sociétés méditerranéennes, des relations entre communautés et entre États colonisateurs et peuples colonisés

Entre réforme sociale et mouvement national

Cet ouvrage est dédié à la mémoire d’Avriel Butovsk