Regulation of IGF-1-dependent cyclin D1 and E expression by hEag1 channels in MCF-7 cells: The critical role of hEag1 channels in G1 phase progression

AbstractInsulin-like Growth Factor-1 (IGF-1) plays a key role in breast cancer development and cell cycle regulation. It has been demonstrated that IGF-1 stimulates cyclin expression, thus regulating the G1 to S phase transition of the cell cycle. Potassium (K+) channels are involved in the G1 phase progression of the cell cycle induced by growth factors. However, mechanisms that allow growth factors to cooperate with K+ channels in order to modulate the G1 phase progression and cyclin expression remain unknown. Here, we focused on hEag1 K+ channels which are over-expressed in breast cancer and are involved in the G1 phase progression of breast cancer cells (MCF-7). As expected, IGF-1 increased cyclin D1 and E expression of MCF-7 cells in a cyclic manner, whereas the increase of CDK4 and 2 levels was sustained. IGF-1 stimulated p21WAF1/Cip1 expression with a kinetic similar to that of cyclin D1, however p27Kip1 expression was insensitive to IGF-1. Interestingly, astemizole, a blocker of hEag1 channels, but not E4031, a blocker of HERG channels, inhibited the expression of both cyclins after 6–8h of co-stimulation with IGF-1. However, astemizole failed to modulate CDK4, CDK2, p21WAF1/Cip1 and p27Kip1 expression. The down-regulation of hEag1 by siRNA provoked a decrease in cyclin expression. This study is the first to demonstrate that K+ channels such as hEag1 are directly involved in the IGF-1-induced up-regulation of cyclin D1 and E expression in MCF-7 cells. By identifying more specifically the temporal position of the arrest site induced by the inhibition of hEag1 channels, we confirmed that hEag1 activity is predominantly upstream of the arrest site induced by serum-deprivation, prior to the up-regulation of both cyclins D1 and E

Oxidative metabolism in cancer

International audienc

Rôle de STAT5 dans la survie des précurseurs lymphocytaires B leucémiques humains (régulation de l'apoptose induite par Fas)

Le développement de la lignée lymphocytaire B est un processus finement contrôlé par des cytokines, des récepteurs spécifiques et des facteurs de transcription. Parmi ces molécules, nous avons étudié le rôle du facteur de transcription STAT5 et de l'IL7 dans la survie de lignées pré-B leucémiques humaines ainsi qu'aux mécanismes régulateurs de l'apoptose induite par Fas. Pour cela, nous avons inhibé les propriétés de la forme endogène de STAT5 grâce à l'introduction de formes dominantes négatives de STAT5 dans des lignées pré-B leucémiques humaines. Nos résultats révèlent que STAT5 et l'IL7 jouent un rôle central dans la survie de ces cellules et que STAT5A régule négativement l'apoptose induite par Fas. Enfin, nous rapportons que le TGF-b protége les lignées pré-B leucémiques de la mort cellulaire induite par Fas. L'ensemble des résultats témoigne du rôle essentiel de STAT5 dans le contrôle de la survie et de l'apoptose des précurseurs B leucémiques humainsAMIENS-BU Santé (800212102) / SudocSudocFranceF

Influence des polymorphismes du gène FCGRT sur la pharmacocinétique des anticorps thérapeutique

Les anticorps monoclonaux thérapeutiques sont utilisés depuis maintenant plus de 20 ans en médecine. Comme pour tout médicament, il a été montré une forte variabilité pharmacocinétique interindividuelle pouvant influencer leur efficacité. La découverte de marqueurs pharmacogénétiques qui influencent cette variabilité est d un intérêt majeur. Nous avons étudié le gène FCGRT codant la chaîne alpha du FcRn, récepteur impliqué dans la distribution et la protection des anticorps thérapeutiques puisqu il est responsable d une part de leur transcytose et d autre part de leur recyclage. Nous avons évalué l influence de deux polymorphismes de FCGRT sur la pharmacocinétique du cétuximab. Il s agit d une part du Variable Number Tandem Repeat (VNTR) situé au niveau du promoteur et connu pour influencer l expression du FcRn et d autre part de la variation du nombre de copies de FCGRT ou CNV (Copy Number Variation). Ces deux polymorphismes ont été étudiés chez 198 témoins sains et chez 94 patients atteints d un cancer colorectal métastatique traité par cétuximab. Les individus homozygotes pour l allèle VNTR3 présentent une plus faible clairance de distribution du cétuximab que les patients hétérozygotes (VNTR2/VNTR3 et VNTR3/VNTR4) (p=0,021). La clairance d élimination quant à elle n est pas influencée par le génotype VNTR. Concernant les CNV, un seul témoin sain (0,5%) et un seul patient (1,1%) présentent plus de 2 copies de FCGRT, les autres individus en présentent 2. Les paramètres pharmacocinétiques du patient avec plus de 2 copies de FCGRT ne diffèrent pas sensiblement de ceux des patients avec 2 copies. Au total, ces résultats montrent que le VNTR du promoteur de FCGRT influence la pharmacocinétique du cétuximab et que les CNV de FCGRT ne peuvent pas être utilisés en tant que marqueur pharmacogénétique de par leur faible fréquence.TOURS-BU Sciences Pharmacie (372612104) / SudocSudocFranceF

Implications des facteurs de transcription et des voies de signalisation cellulaire dans les leucémies aigües lymphoblastiques B (mise en évidence de l'expression et de l'activation de ZAP-70)

Au cours de ce travail, nous nous sommes intéressés à la leucémie aiguë lymphoblastique à cellules B (LAL-B). Nous avons, dans un premier temps, étudié l expression d un panel de facteurs de transcription et de molécules impliquées dans les voies de signalisation cellulaire. Nous décrivons, dans les LAL-B, l expression de ZAP-70, une tyrosine kinase de la famille Syk, dont l expression n avait été jusqu alors décrite chez l homme seulement dans les cellules T, NK et les cellules B matures d une population de leucémie lymphoïde chronique (LLC) de mauvais pronostic. Nous décrivons également son expression dans les progéniteurs lymphoïdes physiologiques B humains pro-B et pré-B précoces. Dans un second temps, pour étudier le rôle de ZAP-70 dans les cellules de LAL-B, nous avons développé une protéine chimérique fusionnant le domaine de transduction protéique de la protéine TAT du virus HIV avec soit une forme sauvage de ZAP-70 ou une forme mutée dans son domaine kinase. La protéine produite ne s est pas révélée active dans les lignées cellulaires T témoins testées et n a donc pas permis d appréhender, par ce biais, le rôle physiopathologique de cette kinase dans les cellules de lignées B. Nous nous sommes intéressés également à la signification de l expression de ZAP-70 dans les LLC de mauvais pronostic. Nous montrons que l expression de ZAP-70 dans ce contexte n est pas corrélée à une résistance pléïotropique aux drogues médiée par l hyperexpression de la glycoprotéine PAMIENS-BU Santé (800212102) / SudocSudocFranceF

T lymphocyte immunophenotyping in bronchoalveolar lavage on AQUIOS CL® cytometer

International audienceBronchoalveolar lavage (BAL) is one of the tests for orientation in the diagnosis of diffuse parenchymal lung disease. Lymphocyte subpopulation study by flow cytometry in the BAL is part of the criteria for the diagnosis of sarcoidosis. We investigated the feasibility of T lymphocyte immunophenotyping in BAL on a new automaton: AQUIOS CL®, a closed access cytometer with fully automated process designed for blood samples. Repeatability and contamination studies showed acceptable results (variation coefficients <5% and contamination indices <1%). We also compared BAL immunophenotyping results performed on AQUIOS CL® with those performed with an open access cytometer: Navios®. The correlation coefficient r is close to 1 on the studied parameters. The number of unacceptable measurement deviations is <5% and does not affect the biological interpretation of the results indicating a good correlation between the two automata. These results show that immunophenotyping in BAL is feasible on AQUIOS CL®

Characterization of the human interleukin-5 gene promoter: involvement of octamer binding sites in the gene promoter activity

International audienceTo investigate the human interleukin (IL)-5 gene promoter, we have constructed a plasmid with the firefly luciferase reporter gene linked to human IL-5 5' flanking sequence (nucleotides -507 to +44). We have used this plasmid to transfect the mouse EL4 T cell line, which can, under certain conditions, produce IL-5 transcripts. Phorbol 12-myristate 13-acetate, A23187 and N6, 2'-O-dibutyryl-adenosine 3':5'-cyclic monophosphate co-stimulation of EL4 cells transfected with the human IL-5/luciferase reporter gene construct resulted in maximal induction of the luciferase gene. Deletion analysis of the IL-5 promoter revealed the presence of negative regulatory elements between nucleotides -404 and -312 and two regions, located between nucleotides -312 and -227 and between nucleotides -80 and -35, that are involved in the positive regulation of the IL-5 promoter. Using electrophoretic mobility shift assays, we show that the positive element located between nucleotides -312 and -227 involves the binding of factors antigenically related to Oct1, Oct2A and Oct2B, to a perfect octamer motif located at position -244/-237. Introduction of three point mutations in the octamer motif of the IL-5/luciferase reporter gene plasmid, which results in the loss of competition for the factors binding to the IL-5 promoter sequence, reduced the production of luciferase from stimulated, transfected EL4 cells, by 90%. Octamer factors can also bind within the second positive regulatory region

Finding the Right Heavy Chains for Immunostimulatory Antibodies

For twelve years, the oncology field has been revolutionized by antibodies targeting immune checkpoints. They must be considered as a heterogenous family of immunostimulatory antibodies displaying very different mechanisms of action, not only depending on the target or on the cells expressing it, but also on the IgG subclass or IgG variant that has been chosen. To dissect this complex landscape, the clinical experience has been confronted with a precise analysis of the heavy chain isotypes, referred as new Ge nomenclature. For antibodies targeting inhibitory receptors, anti-CTLA-4 antibodies (whose main effect is to kill regulatory T cells) will be distinguished from anti-PD-1 antibodies and other true antagonistic antibodies. Antibodies targeting ligands of inhibitory receptors (PD-L1, CD47) represent another different category, due to the antigen expression on tumors and a possible beneficial killing effect. The case of agonistic antibodies targeting lymphocyte activatory receptors, such as CD40 or 4-1BB, is still another “under construction” category because these products are less advanced in their clinical development. Altogether, it appears that choosing the right heavy chain is crucial to obtain the desired pharmacological effect in patients

Insights into the IgG heavy chain engineering patent landscape as applied to IgG4 antibody development

International audienceDespite being the least abundant immunoglobulin G in human plasma, IgG4 are used therapeutically when weak effector functions are needed. The increase in engineered IgG4-based antibodies on the market led us to study the patent landscape of IgG4 Fc engineering, i.e., patents claiming modifications in the heavy chain. Thirty-seven relevant patent families were identified, comprising hundreds of IgG4 Fc variants focusing on removal of residual effector functions (since IgG4s bind to FcγRI and weakly to other FcγRs), half-life enhancement and IgG4 stability. Given the number of expired or soon to expire major patents in those 3 areas, companies developing blocking antibodies now have, or will in the near future, access to free tools to design silenced, half-life extended and stable IgG4 antibodies

La région charnière des anticorps thérapeutiques

La région charnière est une courte séquence des chaînes lourdes (H) d’anticorps liant le Fab (fragment antigen binding) au Fc (fragment crystallisable). Les propriétés fonctionnelles des quatre sous-classes d’immunoglobulines d’isotype G (IgG) résultent en partie des différences de séquence de leurs régions charnières. En effet, certains acides aminés de la partie C-terminale de ces régions charnières (« partie basse ») sont situés au sein ou à proximité des sites de liaison de la molécule C1q de la voie classique du complément et des récepteurs pour la région Fc des IgG (RFcγ) sur les chaînes H d’IgG. Les régions charnières sont également sensibles au clivage protéolytique par de nombreuses protéases du microenvironnement tumoral et/ou inflammatoire pouvant altérer les réponses fonctionnelles. Le format optimal de la charnière reste donc un défi majeur pour le développement de nouveaux anticorps thérapeutiques