Expression of multidrug resistance membrane transporter (Pgp) and p53 protein in canine mammary tumours

The aim of this study was to determine the expression rate of P-glycoprotein (Pgp), a multidrug resistance marker and the p53 tumour-suppressor protein in canine mammary tumours. A total of 30 tumours were examined in parallel to patient history. The tumours were allotted to four groups: tubulopapillar carcinomas, complex carcinomas, benign tumours, and other malignant tumours. A monoclonal mouse antibody (C494) was used for the immunohistochemical evaluation of Pgp and a polyclonal rabbit antibody for p53. We found that the intact ductal epithelium and connective tissue showed pronounced Pgp expression. The most intensive staining was detected in tubulopapillar carcinomas for both Pgp and p53. The expression rate of Pgp and p53 differed significantly between tubulopapillar carcinoma and complex carcinoma, and between tubulopapillar carcinoma and benign mammary tumour, respectively. The expressions of Pgp and p53 highly correlated statistically; therefore, both can determine malignancy in a similar manner. In the case of tubulopapillar carcinomas, more relapsed tumours occurred than in relation to complex carcinomas and other malignant tumours. Pgp expression rate was proportional to the probability of the tumour becoming recidivant postoperatively, as well. These results suggest that routine evaluation of Pgp expression in canine mammary tumours may be prognostically helpful

A daganatos sejtek proliferációs hajlamának, valamint szabadgyökös és antioxidáns tulajdonságainak vizsgálata kutyák non-Hodgkin-típusú lymphoblastos lymphomájában

A magvacska-szervező régió (AgNOR) festési módszer alkalmazása a sejtek proliferációs hajlamának megítélésre: Testűri folyadékgyülemekből és nyirokcsomókból származó citológiai mintákban megállapítottuk, hogy a daganatos jelleget jobban jelzi, ha a sejtenkénti AgNOR-számok mellett azok eloszlását is elemezzük. Lymphomás kutyák nyirokcsomóinak citológiai és szövettani mintáiban, a betegekben az AgNOR-számok nagyobbak de, citológiai módszerrel nagyobb értékek tapasztalhatók. Az AgNOR-számok különböznek a daganatos sejtekben a malignitás szerint. Lymphomás kutyák nyirokcsomómintáiban mért AgNOR-felületi értékek és a betegek recidívamentes ideje között nem volt összefüggés. Az antioxidáns védekezés vizsgálata egészséges és lymphomás kutyákban: Megállapítottuk, hogy a betegek antioxidáns védekezése rosszabb az egészségesekénél. A beteg kutyák nyiroksejtjei kisebb mértékben reagáltak szabadgyök-képző stimulációra, és több szabadgyököt tartalmaznak, mint az egészségeseké. A sejtek proliferációjának fokozódásával nő a nyirokszövetben a szabadgyökök koncentrációja, és romlik a nyirokcsomók és a vér antioxidáns státusza. Feltételezzük, hogy a daganatos betegekben az antioxidáns védekező mechanizmus változása is okozza a szervfunkciókat jelző paraméterek értékeinek változását. A citosztatikus kezelés hatására az antioxidáns védekező rendszer károsodik a kezelés első és ötödik hetén, majd javul. | Staining of argyrophil nucleolar organizer region (AgNOR) in order to indicate proliferative character of cells: Examining body cavity fluids and lymph nodes, we found that neoplastic character of cells can be indicated by AgNOR-method, but it is better to examine both, AgNOR-counts and their arrangement, too. In lymph node samples prepared by histological and cytological methods AgNOR counts were higher in samples of dogs with lymphoma, than in healthy dogs, while the values were higher in cytological specimens. AgNOR counts were different in animals with high or low grade types of lymphoma. AgNOR-area measurements in lymph node samples did not show changes between dogs with different remission free periods.Examination of antioxidant defence in healthy dogs and dogs with lymphoma:We found that the antioxidant defence is impaired in dogs with lymphoma. Response to the stimulus to form free radicals in lymphatic cells is worse in lymphoma than in healthy cases, while diseased lymph nodes contained more free radicals. There is positive correlation between proliferation ability of cells and free radical concentration and negative between the proliferation ability and antioxidant defence in lymph nodes. We suppose that the change in antioxidant defence can alter the value of parameters used to indicate the function of organs. The antioxidant defence mechanism is damaged at the 1st and the 5th week of cytostatic treatment then becomes ameliorated

A terápierezisztencia vizsgálata kutyák daganatos, immunológiai és szívelégtelenséggel járó kórképeiben = Examination of multidrug resistance in canine neoplastic immune mediated and cardiac disorders

Daganatszövetben, azokból és vérből elkülönített sejtekben mutattuk ki az multidrog rezisztencia- (MDR-) fehérjéket immunhisztokémiai (IHC), western blot, ill. a kódoló mRNS-ek mennyiségét, és rt-PCR-es módszerekkel. Az MDR funkciót áramlási (flow) citométeres (FC) és szcintigráfiás (SC) módszerrel is elemeztük. Megállapítottuk, hogy kutyák lymphomájában, a „b” alstádiumú, és T-sejtes immunfenotípusú, nem teljes remissziót mutató, nőstény ivarú esetekben, és a tubulopapillaris ED-kben a Pgp (MDR1) IHC expresszió mértéke szignifikánsan nagyobb a többi esethez képest, ennek mértéke korrelál a rövidebb recidívamentes túléléssel, és a rövidebb élettartammal. Hasonlóan prognosztikus információra jutottunk az in vitro FC (Calcein-teszt), és az in vivo SC (99mTc-MIBI) funkcionális tesztekkel. Az FC vizsgálatok alkalmasok voltak a vérben keringő lymphocytákban a kemoterápia során indukálódó fokozott MDR- transzporter funkció vizsgálatára is. Kutyák nyirokcsomójából izolált „short-term” túlélő sejtek kemoterápiás kezelésének apoptosis vizsgálata alapján megállapítottuk, hogy a doxorubicin a ciklofoszfamiddal, a vinkrisztin a metilprednizolonnal keresztrezisztenciát mutat. Kutyák lymphomájában vizsgáltuk az MDR1, mrp1, mrp2, BCRP membrántranszporterek mRNS-szintjét, azt találtuk, hogy az MDR1, ill. BCRP expressziók mennyiségei prognosztikusnak minősülnek. Szívbeteg, és immun-betegségben szenvedő kutyák lymphocytáinak MDR1, mrp1, mrp2, BCRP mRNS-expresszió szintjeit is vizsgáltuk nem kellő elemszámban. | Multidrug resistance (MDR) proteins were detected by immunohistochemical (IHC), western-blot, techniques and mRNA levels were determined by rt-PCR method in tumour tissues, separated tumour cells, and lymphocytes of peripheral blood. MDR functional tests were performed by flow cytometric (FC) and scyntigraphic (SC) methods. We’ve found that Pgp (MDR1) IHC expression levels were significantly higher in canine lymphoma with “b” substage, T-cell tpye, non complete remission, female and in MGTs in tubulopapillary forms compared to other cases. Higher expression levels were correlating with the shorter relapse free periods (RFP), and overall survival times (OST). Similar prognostic information could be gained by the in vitro FC (Calcein) test, and the in vivo SC (99mTc-MIBI) method. Calcein test was useful for the determination of increased MDR function which is induced in small lymphocytes of peripheral blood during cytostatic treatment. Isolated cells derived from lymph nodes of dogs with lymphoma were examined in “short term” cell cultures treated in vitro by chemotherapy drugs showed similarity in apoptosis between doxorubicin-cyclophosphamide and vincristine-methylprednisolone. Rt-PCR examinations were performed in canine lymphoma for the determination of mRNA expression levels of MDR1, mrp1, mrp2, BCRP. We’ve found that MDR1 and BCRP levels revealed to be prognostic in respect of RFP, and OST. MDR1, mrp1, mrp2, BCRP mRNA levels were determined in dogs with cardiac and immune- disease, the number of cases was not sufficient

Terápiarezisztens fehérjék, szabadgyökök és antioxidánsok szerepe kutya limfómájában = Role of therapy resistant proteins, free radicals and antioxidants in the prognosis of canine lymphomas

1. Állatorvoslásban hasznositható paramétereket kerestünk daganatos betegek szempontjából. Egyre több ilyen kutya és macska (páciens) jelenik meg az állatorvosi klinikákon, anélkül, hogy a szakemberek tudnák, mit kezdjenek velük. Célunk volt felkutatni olyan antioxidáns paramétereket, amelyek diagnosztikai vagy terápiás értékkel birnak. A redukalt glutation mennyisege a vérben egy ilyen prognosztikai parameter lehet. 2. Másik célunk volt a kemoterapiának alávetett állatokból mért transzporterek vizsgálata. A kemorezisztencia a legfőbb gát a páciensek gyógyulásában. Western blot analizissel és rt-PCR technikával is kimutattuk, hogy bizonyos MDR fehérjék expressziójánál a páciensek túlélési leheteősége jobb vagy rosszabb. Magyarul, érdemes-e egy kutyát vagy macskát költséges terápiának alávetni, ha a transzporter paraméterei ezt nem igazolják? 3. Mivel a konvencionális kemoterápia növeli a kemorezisztenciát, ezért egy alternativ gyógymódhoz fordultunk. Ez egy viszonylag ártalmatlan, ámde fényérzékeny prekurzórra épülő terápia, ahol is a betegnek egy fényre reagáló vegyületet adunk be és félhomályban csak a tumorját világitjuk be. Ezt fotodinamikus terápiának nevezzük és Közép-Keleteurópában mi vezettük be elsőként a SzIe Állatorvostudományi Karán. Az érdeklődés az eljárás iránt tömeges. | 1. Veterinary sciences and diagnostics are in need of oxidative parameters regarding tumor patients. Dogs and cats with weird symptoms show up at veterinary clinics, and specialists do not even recognize the disease. Our research shows that the amount of reduced glutathione in blood can be a good candidate for being a marker of possibility of cancer or other malignant disease. 2. Multidrug resistance proteins (MDR) were another issue of our investigations. Chemoresistance is one of the major problems of chemotherapy. We have shown by Western blot and rt-PCR analyses that survival of dogs is related to their expression of tumor MDR proteins. Consecuently, it is not worth to treat a dog with conventional chemos if its tumor overexpresses specific MDR proteins. 3. Conventional therapies fail in many cases. Photodynamic therapy is a promising alternative to treat cats and dogs with some kinds of tumors. It uses a harmless photosensitizer and a source of visible light. We have recently introduced photodynamic therapy of tumors at the SzIE University of Veterinary Sciences. Success of the treatment is overwhelming. We got more positive feedback than expected. This is the first and only oncological PDT therapy trial in Central Europe

Evaluation of Pgp (MDR1) immunohistochemistry in canine lymphoma – prognostic and clinical aspects

Permeability glycoprotein (P-glycoprotein, Pgp) immunohistochemistry (IHC) was evaluated in dogs with multicentric lymphoma treated with cyclophosphamide– doxorubicin–vincristine–prednisolone with or without L-Asparaginase. Lymph nodes of 33 untreated dogs were immunophenotyped: Ki67% and Pgp analyses (with anti-Pgp, monoclonal mouse C494 clone) were performed. Pgp positivity rate and intensity were determined microscopically (by manual counting done by two blinded authors in two parallel specimens). The median overall survival time (OST) was 333 days and the relapse-free period (RFP) 134 days. Pgp expressions were positive in 18 out of 33 (54.5%) of tumour cells. T-cell types stained more intensively. Lower OST and RFP were found with Pgp positivity ≥ 35% (OST: 240 days, RFP: 95 days) compared to Pgp positivity < 35% (OST: 428 days, RFP: 232 days). Intensive staining was associated with a lower OST and RFP (240 and 103 days, respectively) than weak staining (428 and 221 days, respectively). Death due to adverse drug reactions was best predicted at Pgp positivity ≤ 6.5% (sensitivity/specificity: 0.55/0.81) and ≤ 123 days (sensitivity/ specificity: 0.55/0.86). Pgp evaluation by IHC can have prognostic value with a properly established Pgp% positivity cut-off value in dogs treated with Pgp substrate drugs

Az antioxidáns rendszert befolyásoló tényezők vizsgálata emlős állatfajokban = Studies on factors influencing the antioxidant system in mammalian animal species

Vizsgálataink során megállapítottuk, hogy tejelő tehenekben a védett kolin etetése javította a metabolikus állapotot, ugyanakkor a vér és a máj redox mutatóira nem volt hatása. Ugyancsak tejelő tehenekben a hidrogénezett zsírral történő takarmánykiegészítésnek kedvezőbb metabolikus hatása volt, mint a Ca-szappannak, de egyik sem befolyásolta a vér es a máj redox mutatóit. Anyajuhokban a konjugált linolsavval történő takarmány-kiegészítés kedvező metabolikus hatással rendelkezik, de nem befolyásolja a vér redox mutatóit. A normoglycaemiás és hypoglycaemiás vemhes anyajuhok vérének redox mutatói az ellés előtt és után is hasonlóak, és a bárányozás sem hat ezekre a paraméterekre. A hypoglycaemiás anyák bárányainak redox mutatói hasonlóak a normoglycaemiás anyák utódaihoz. Eredményeink alapján az újszülött bárányok antioxidáns védelme jobb, mint az anyajuhoké. A mieloperoxidáz (MPO) enzim aktivitása a vérplazmában egészséges tehenekben és lovakban alig mérhető, míg egészséges sertésekben és kutyákban annak értéke 30-90 U/L. Vesebeteg kutyában a vér stacioner szabadgyök mennyisége szignifikánsan nagyobb, mint az egészségesekben. A malondialdehid tartalom a hidroxi-nonenal koncentrációval kiegészítve a lipidperoxidáció fokozódását jelzi. A protein?karboniláció, a szuperoxid dizmutaz aktivitása és a plazma antioxidáns-kapacitása nagyobb a vesebeteg kutyák vérplazmájában. A vesebeteg kutyák vérmintáiban ennek alapján kimutatható az oxidatív stressz jelenléte. | Protected choline in dairy cows improved the general metabolic status of the cows, but had no effect on the redox systems of the blood and liver. Supplementation of the ration with hydrogenated fat in dairy cows has a better effect on the metabolism than supplementation with Ca-soaps. Neither of the fat supplementations influence the redox variables of the cows` blood and liver. Supplementation of the daily ration of ewes with conjugated linoleic acid improves the overall metabolic capacity and has no effect on the blood redox parameters. Normoglycaemic and hypoglycaemic pregnant ewes have similar blood redox variables either before, at, or after lambing. Lambs of both normoglycaemic and hypoglycaemic ewes have similar blood redox compounds. The blood of newborn lambs has stronger antioxidant capacity than the blood of their mothers. Myeloperoxidase (MPO) activity of blood plasma in healthy cows and horses is very low whilst in pigs and dogs it is between 30-90 U/L. Free radical concentration of the blood in dogs with renal diseases is significantly higher than in healthy ones. High malondialdehyde and 4-hydroxinonenal concentration proves the presence of increased lipid peroxidation. Increased oxidative protein carbonylation, superoxide dismutase activity and total antioxidant capacity characterise the blood of dogs with renal insufficiency. These results are consequences of oxidative stress present in dogs with renal disease

Az antioxidáns rendszer ontogenezisének vizsgálata emlős állatfajokban = Studies on the ontogenesis of the antioxidant system in mammalian animal species

Újszülött malacok, csikók, bárányok és borjak vérében vizsgáltuk az antioxidáns rendszert. A vizsgálatokat a költségelvonás miatt csökkentettük, a témával kapcsolatos, részben más támogatású kísérleteket is bevontunk. Az újszülöttekben az anyaállatokhoz képest erős oxidatív hatást észleltünk, amit malacokban és borjakban elektronspin-rezonanciás mérésekkel is igazoltunk. Az antioxidáns védelem az újszülöttekben kivédte születési oxigén-stresszt. A vvs-MDA az élet első 3 hetében nagyobb volt a kérődzőkben, mint a csikókban és a malacokban. A vvs-MDA az idővel nem változott. A vérplazma nem enzimatikus védelmét jelző FRAP és az enzimatikus védelmet is jelző TAS értéke az újszülöttekben minden esetben jelentősen meghaladta az anyaállatokét. A FRAP később minden fajban, míg a TAS három fajban csökkent, a malacokban nőtt. A fajok antioxidáns rendszerének ontogenezise tehát eltér, amit a születéskori hemoglobin (fetalis/felnőttkori) aránya, a születés lefolyása, a fejlődési erély, a takarmányozás változásai befolyásolhatnak. Az ellés oxidatív stresszt okozó hatását tehenekben igazoltuk. ESR-rel bizonyítottuk, hogy csirke modellállaton is jelentős a kelés okozta oxidatív terhelés. Lymphomás kutyákban igazoltuk az antioxidáns védelem romlását. Nyulakban a hátizom zsírsavösszetételét és redox állapotát tanulmányoztuk. Tehenekben és házityúkban kolin- illetve zsírkiegészítéssel a az antioxidáns védelmet nem tudtuk jelentősen befolyásolni. | The antioxidant system was studied in the blood of newborn pigs, foals, lambs and calves during the first 3 weeks of life. As experiments had to be reduced due to cut of the budget, some related experiments were also used in the project. In newborns stronger oxidative damage was found than in the mothers, proved by measurement of free radicals by ESR spectrometry in pigs and calves. The antioxidant system protected the newborns from oxidative stress at birth. RBC-MDA was higher in the ruminants than in the piglets and foals during the first 3 weeks of life and did not change with age. Non-enzymatic defence of blood plasma (FRAP), and total antioxidant status (TAS) was significantly stronger in newborns than in adults. FRAP decreased in all species while TAS decreased in three and increased in pigs. Results proved a marked difference in the ontogenesis of the antioxidant system among species that might be explained by differences in hemoglobin structure of the newborns, process of delivery, growth development, and nutrition. The oxidative stress caused by calving was proven in dairy cows. In chicks ESR studies showed that hatching caused oxidative stress. In dogs with lymphoma the antioxidant defence decreased. Changes of the fatty acid composition and redox state in rabbit's muscle after electrical stimulation was significant. In cows and chicks we could not influence the antioxidant system by supplementation of food with choline and fat

Assessment of adrenocortical reserve capacity and inflammatory parameters in critically ill dogs

Inflammatory markers and adrenocorticotropic hormone (ACTH) stimulation test results may help us recognise critically ill dogs with poor disease outcome. Systemic inflammatory response syndrome (SIRS) criteria, the fast version of the Acute Patient Physiologic and Laboratory Evaluation Score (APPLEfast), complete blood count, albumin and C-reactive protein (CRP) levels, baseline and stimulated cortisol levels and Δcortisol value were recorded in 50 client-owned dogs admitted to the Small Animal Hospital of the University of Veterinary Medicine Budapest with various inflammatory or neoplastic conditions. Increasing APPLEfast score was associated with a decreasing chance of survival (P = 0.0420). The Δcortisol value was significantly higher in SIRS dogs than in non-SIRS dogs (mean ± SD ΔcortisolSIRS: 342.5 ± 273.96; mean ± SD Δcortisolnon-SIRS: 175.3 ± 150.35; P = 0.0443). Elevated baseline or stimulated cortisol levels were associated with a higher chance of non-survival (P = 0.0135 and P = 0.0311, respectively). These data indicate that pathologically higher baseline and stimulated cortisol levels represent an exaggerated stress response in critically ill dogs, which is negatively associated with survival

Celecoxib Prevents Doxorubicin-Induced Multidrug Resistance in Canine and Mouse Lymphoma Cell Lines.

BACKGROUND: Treatment of malignancies is still a major challenge in human and canine cancer, mostly due to the emergence of multidrug resistance (MDR). One of the main contributors of MDR is the overexpression P-glycoprotein (Pgp), which recognizes and extrudes various chemotherapeutics from cancer cells. METHODS: To study mechanisms underlying the development of drug resistance, we established an in vitro treatment protocol to rapidly induce Pgp-mediated MDR in cancer cells. Based on a clinical observation showing that a 33-day-long, unplanned drug holiday can reverse the MDR phenotype of a canine diffuse large B-cell lymphoma patient, our aim was to use the established assay to prevent the emergence of drug resistance in the early stages of treatment. RESULTS: We showed that an in vitro drug holiday results in the decrease of Pgp expression in MDR cell lines. Surprisingly, celecoxib, a known COX-2 inhibitor, prevented the emergence of drug-induced MDR in murine and canine lymphoma cell lines. CONCLUSIONS: Our findings suggest that celecoxib could significantly improve the efficiency of chemotherapy by preventing the development of MDR in B-cell lymphoma

Celecoxib Prevents Doxorubicin-Induced Multidrug Resistance in Canine and Mouse Lymphoma Cell Lines

Background: Treatment of malignancies is still a major challenge in human and canine cancer, mostly due to the emergence of multidrug resistance (MDR). One of the main contributors of MDR is the overexpression P-glycoprotein (Pgp), which recognizes and extrudes various chemotherapeutics from cancer cells. Methods: To study mechanisms underlying the development of drug resistance, we established an in vitro treatment protocol to rapidly induce Pgp-mediated MDR in cancer cells. Based on a clinical observation showing that a 33-day-long, unplanned drug holiday can reverse the MDR phenotype of a canine diffuse large B-cell lymphoma patient, our aim was to use the established assay to prevent the emergence of drug resistance in the early stages of treatment. Results: We showed that an in vitro drug holiday results in the decrease of Pgp expression in MDR cell lines. Surprisingly, celecoxib, a known COX-2 inhibitor, prevented the emergence of drug-induced MDR in murine and canine lymphoma cell lines. Conclusions: Our findings suggest that celecoxib could significantly improve the efficiency of chemotherapy by preventing the development of MDR in B-cell lymphoma