Differential gene expression in focal cerebral ischemia: transcript identification and - characterization

Titelblatt und Inhaltsverzeichnis Einleitung Aufgabenstellung Material Methoden Ergebnisse Diskussion Zusammenfassung LiteraturverzeichnisZiel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung, Bestätigung und weitere Charakterisierung noch unbekannter ischämierelevanter differentiell exprimierter Gene auf der Grundlage der Daten eines SAGE-Projektes an einem in vivo-Modell der transienten fokalen cerebralen Ischämie im Maushirn. Da die korrekte Sequenzdatenbank-basierte SAGE-tag-Gen-Zuordnung problematisch ist, wurde eine verbesserte PCR-basierte Methode zur Identifizierung der korrespondierenden SAGE-tag spezifischen Transkripte etabliert. In Anlehnung an das RACE (rapid amplification of cDNA ends)-PCR Prinzip wurde die Methode SARA-PCR (SAgeRAce) genannt. Sie beruht auf einer Isolation 3`terminaler cDNA Restriktionsfragmente unter Verwendung paramagnetischer Kügelchen und der Ligation von Linkern an die cDNA vor dem nachfolgenden Amplifikationsschritt. Im Gegensatz zu früher beschriebenen Amplifikationsmethoden profitiert das Protokoll von der Länge der tag-spezifischen Plusprimer und erlaubt stringente PCR-Bedingungen. Es ermöglichte eine zuverlässige tag-Gen-Zuordnung auch für tags mit unklarer Datenbankzuordnung. Weiterhin wurde demonstriert, dass die SARA-PCR - durchgeführt als Real Time PCR mit der Light Cycler-Technik - quantitative Informationen liefert und zur Bestätigung der differentiellen Expression spezifischer SAGE-tags verwendet werden kann. Die SARA-PCR ist zeitsparend, wenig arbeitsintensiv und zur Genidentifizierung in großem Umfang geeignet. Zwei zugeordnete, differentiell exprimierte SAGE-Gene wurden molekularbiologisch weiter charakterisiert.The aim of this study was identification, confirmation and further characterization of differentially expressed genes in mouse brain after the induction of focal cerebral ischemia on the basis of a Serial analysis of gene expression (SAGE). SAGE is a powerful method for large-scale analysis of gene expression patterns and yields digital information on transcript abundance by the use of short sequence fragments (tags). It does not require a priori knowledge of the expressed genes in the starting material, SAGE can be used for gene discovery. Unfortunately, correct tag-to-gene-allocation after SAGE remains difficult or even impossible when the short sequence of the tag corresponds to more than one gene in the reference database or when novel, yet uncloned genes were detected. To overcome this problem, we developed an improved protocol for the proper identification of tag-corresponding genes. It relies on the isolation of 3´-terminal cDNA restriction fragments by the use of paramagnetic streptavidin beads, and the ligation of linkers prior to the amplification step. Because the principle is related to rapid amplification of cDNA ends (RACE)-PCR, this approach was termed SARA-PCR, where SA stands for SAGE and RA for RACE-PCR. In contrast to competing protocols, stringent PCR conditions can be applied because of the length of the specific primers, which are composed of linker- and tag-specific sequences. Additionally, it is demonstrated that the protocol yields quantitative information, which can be used for further expression analysis of specific SAGE tags. Additional two allocated differentially expressed SAGE-genes in focal cerebral ischemia were further characterized