Sequence variation in CYP51A from the Y strain of Trypanosoma cruzi alters its sensitivity to inhibition

CYP51 (sterol 14α-demethylase) is an efficient target for clinical and agricultural antifungals and an emerging target for treatment of Chagas disease, the infection that is caused by multiple strains of a protozoan pathogen Trypanosoma cruzi. Here, we analyze CYP51A from the Y strain T. cruzi. In this protein, proline 355, a residue highly conserved across the CYP51 family, is replaced with serine. The purified enzyme retains its catalytic activity, yet has been found less susceptible to inhibition. These biochemical data are consistent with cellular experiments, both in insect and human stages of the pathogen. Comparative structural analysis of CYP51 complexes with VNI and two derivatives suggests that broad-spectrum CYP51 inhibitors are likely to be preferable as antichagasic drug candidates.Fil: Cherkesova, Tatiana S.. National Academy of Sciences of Belarus. Institute of Bioorganic Chemistry; BielorrusiaFil: Hargrove, Tatiana Y.. Vanderbilt University; Estados UnidosFil: Vanrell, Maria Cristina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Cienicas Médicas. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos; ArgentinaFil: Ges, Igor. Vanderbilt University; Estados UnidosFil: Usanov, Sergey A.. National Academy of Sciences of Belarus. Institute of Bioorganic Chemistry; BielorrusiaFil: Romano, Patricia Silvia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Cienicas Médicas. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos; ArgentinaFil: Lepesheva, Galina I.. Vanderbilt University; Estados Unido

Mechanism of Oxygen Activation in Hydroxylation Reactions Involving Cytochrome P450

In the 20-37 °c range the kinetics of cyclohexene epoxidation, naphthalene and cyclohexane hydroxylation and oxidative demethylation of a group of amines in the presence of rat liver microsomes, NADPH and 0 2 has been studied

Mechanism of Oxygen Activation in Hydroxylation Reactions Involving Cytochrome P450

In the 20-37 °c range the kinetics of cyclohexene epoxidation, naphthalene and cyclohexane hydroxylation and oxidative demethylation of a group of amines in the presence of rat liver microsomes, NADPH and 0 2 has been studied

ИССЛЕДОВАНИЕ ТРАНСМЕМБРАННОГО БЕЛКА CD79B МЕТОДОМ МНОГОМЕРНОЙ ИМПУЛЬСНОЙ ЯМР СПЕКТРОСКОПИИ

In the present work, using the cell-free expression system, we prepared the proteins CD79A/CD79B labeled by stable isotopes of carbon-13 and nitrogen-15. It is shown that target proteins are mostly localized in the pellet of the cell-free expression system, which is consistent with their membrane nature and the presence of a transmembrane domain in their structure. Physicochemical parameters of the CD79A/CD79B samples were defined to obtain the multidimensional correlation NMR spectra of high resolution. The analysis of the obtained correlation spectra shows that under experimental conditions, CD79B exists in the disordered state. The splitting of the signal from the NH-group of the side chain of single tryptophan residue indicates the presence of slow conformational transitions in this region of the polypeptide chain. The addition of the trifluoroacetic acid to the solution of CD79B in DMSO leads to the destruction of the intermolecular bonds of “protein micelles” and the formation of its monomeric form that is well detectable by NMR. В настоящей работе с использованием системы бесклеточной экспрессии получены меченые стабильными изотопами углерода-13 и азота-15 белки CD79A/CD79B. Установлено, что целевые белки обнаруживаются в осадке бесклеточной системы экспрессии, что согласуется с их мембранной природой и наличием трансмембранного домена в их составе. Определены физико-химические параметры образцов CD79A/CD79B с целью получения многомерных корреляционных ЯМР спектров высокого разрешения. Анализ полученных корреляционных спектров свидетельствует, что CD79B при выбранных условиях находится в неупорядоченном состоянии. Расщепление сигнала от NH- группы боковой цепи единственного остатка триптофана указывает на наличие медленных конформационных превращений в этой области полипептидной цепи. Добавление трифторуксусной кислоты к раствору CD79B в диметил- сульфоксиде приводит к разрушению межмолекулярных связей «белковой мицеллы» и образованию его мономерной формы, хорошо детектируемой ЯМР спектроскопией.

In silico анализ влияния фосфорилирования на структуру стероид-гидроксилаз человека CYP17A1 И CYP19A1

The trajectories of molecular dynamics simulation of phosphorylated S258 (CYP17A1), T162 and Y361 (CYP19A1) were analyzed to understand a possible mechanism of influence of post-translational modification (PTM) on the structure and functions of human sterol-hydroxylases CYP17A1 and CYP19A1. It was found that PTM has no dramatic influence on the structures of the enzymes but stabilizes them. According to our data, the phosphorylation of S258, T162 and Y361 influences the interface of interaction between human sterol-hydroxylases and the corresponding electron donors by decreasing the mobility of amino acids that take part in forming molecular complexes of the enzymes and the corresponding redox-partners. The phosphorylation of T162 (CYP19A1) decreases the mobility of amino acids forming access channel. The obtained results can shed light on the mechanism of fast regulation of human CYP17A1 and CYP19A1 activity by PTM.С целью изучения влияния пост-трансляционных модификаций (ПТМ) на структуру и функции стероид-гидроксилаз человека CYP17A1 и CYP19A1 проведен анализ траекторий молекулярной динамики ферментов, содержащих модифицированные фосфогруппами аминокислотные остатки S258 (CYP17A1), T162 и Y361 (CYP19A1). Показано, что наличие ПТМ в структуре белка не приводит к значительным изменениям пространственной структуры ферментов и увеличивает общую стабильность белковой глобулы. Установлено, что фосфорилирование S258, T162 и Y361 оказывает влияние на интерфейс взаимодействия стероид-гидроксилаз с соответствующими донорами электронов путем уменьшения подвижности аминокислотных остатков, участвующих в формировании молекулярных комплексов с редокс-партнерами. Обнаружено, что фосфорилирование T162 (CYP19A1) приводит к уменьшению подвижности аминокислотных остатков, формирующих канал доступа субстрата в активный центр фермента. Полученные результаты проясняют механизм быстрой регуляции активности CYP17A1 и CYP19A1 человека посредством ПТМ

СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЦИТОХРОМА P450 7B1 ЧЕЛОВЕКА С АМИНОКИСЛОТНОЙ ЗАМЕНОЙ Phe470Ile

To study the influence of the amino acid substitution of Phe470Ile, correlating with the spastic paraplegia of type 5, on the structure of human cytochrome P450 7B1, the spatial full-atomic models of this enzyme and its mutant form were created. It was found that Phe470 does not influence directly the catalytic properties of the enzyme because of its localization far from the active site. It was shown that the residue under investigation belongs to a highly conservative region of the protein structure and can influence the CYP7B1 correct folding. In particular, the amino acid substitution of Phe470Ile increases rigidity and stability of sterol 7α-hydroxylase. This can be a reason of changes in the CYP7B1 hydroxylase activity in relation to neurosteroids.С целью изучения влияния аминокислотной замены Phe470Ile, коррелирующей с возникновением спастической параплегии типа 5, на пространственную структуру цитохрома P450 7B1 человека построены компьютерные модели данного фермента и его варианта с соответствующей мутацией. Установлено, что Phe470 не влияет напрямую на каталитические свойства фермента в силу того, что он локализован далеко от активного центра фермента. Однако расположение 470 остатка в высоко консервативной области белка свидетельствует о его важной роли в формировании корректной пространственной структуры исследуемой стероид 7α-гидроксилазы. В частности, аминокислотная замена Phe470Ile приводит к увеличению жесткости и, как следствие этого, стабильности пространственной структуры CYP7B1, что может являться причиной изменения профиля гидроксилазной активности фермента по отношению к нейростероидам

РАЗНОСТНАЯ ЯМР СПЕКТРОСКОПИЯ С ПЕРЕНОСОМ НАСЫЩЕНИЯ В ИССЛЕДОВАНИИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЦИТОХРОМА Р450cam С 4-ФЕНИЛИМИДАЗОЛОМ: ОБНАРУЖЕНИЕ НОВОГО ПРОМЕЖУТОЧНОГО СОСТОЯНИЯ КОМПЛЕКСА

The present work is devoted to the investigation of the interaction of cytochrome P450cam with 4-phenylimidazole (4-PI) using spectrophotometry and NMR spectroscopy. The data obtained by the STD-NMR method indicate the existence of an intermediate short-lived state of 4-phenylimidazole in the active site of P450cam where 4-phenylimidazole is bound to the inner region of the active site and/or to the substrate access channel without the formation of a coordination bond between the ligand azole group atoms and the heme iron atom. In this article, we first used the STD-NMR method to study the interaction of cytochrome P450 with ligand. The equilibrium dissociation constant of the P450cam-4-PI complex, which was calculated using the dependence of the amplification factor at zero saturation time (10.4 mM), differs from the constant that was calculated at constant saturation time (34.6 mM). This fact indicates the dependence of the Kd determination using STD-NMR at saturation time and concentrations of interacting substances. Comparison of the dissociation energy for the intermediate complex (11.2 kJ) relative to the direct coordination complex (28.5 kJ) suggests that the main contribution to the protein-ligand interaction is related to the hydrophobic interaction of 4-PI with the inner surface of the cavity of the active site of P450cam. The observed intermediate state makes it possible to explain the formation of hydroxylated forms of azole inhibitors during the interaction with cytochromes P450, when an inhibitor is in an intermediate form as a substrate and is not bound by a coordination bond with a heme iron atom. Настоящая работа посвящена исследованию взаимодействия цитохрома P450cam c 4-фенилимидазолом (4-PI) методом спектрофотометрии и ЯМР спектроскопии. Полученные методом разницы переноса насыщения ЯМР (РПН-ЯМР) данные указывают на существование промежуточного короткоживущего состояния 4-фенилимидазола в активном сайте P450cam, где 4-фенилимидазол связан с внутренней областью активного сайта и/или областью канала доступа субстрата без образования координационной связи между атомами азольной группы лиганда и атомом железа гема. В данной работе нами впервые применен метод РПН-ЯМР для исследования взаимодействия цитохрома P450 c лигандом. Равновесная константа диссоциации комплекса P450cam–4-PI, рассчитанная с использованием зависимости фактора амплификации РПН при нулевом времени насыщения, составляет 10,4 мМ и отличается от константы, рассчитанной при постоянном времени насыщения (34,6 мМ), что указывает на зависимость определения Kd при использовании РПН-ЯМР от времени насыщения и концентраций взаимодействующих веществ. Сравнение энергии диссоциации для промежуточного комплекса (11,2 кДж) относительно комплекса с прямой координацией (28,5 кДж) позволяет предположить, что основной вклад во взаимодействие белок–лиганд вносит гидрофобное взаимодействие 4-PI с внутренней поверхностью полости активного сайта Р450cam. Обнаруженное промежуточное состояние позволяет объяснить образование гидроксилированных форм ингибиторов азольной природы при взаимодействии с цитохромами P450, когда ингибитор находится в промежуточной форме в качестве субстрата, без образования координационной связи с атомом железа гема.

САЙТ-СПЕЦИФИЧНОЕ БИОТИНИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ, ИММОБИЛИЗОВАННЫХ НА МИКРОЧАСТИЦАХ, РЕКОМБИНАНТНОЙ БИОТИН ЛИГАЗОЙ

To obtain catalytically active recombinant biotin ligase (rBirA), we developed an approach for heterologous expression of BirA-MBP-fusion protein in E. coli cells, its purification and subsequent rBirA release by highly specific proteolysis using TEV protease. The recombinant protein is obtained in homogeneous state and retains specific catalytic activity. Enzyme immobilization on magnetic microparticles has allowed to develop an approach for effective enzymatic biotinylation combined with purification of target protein molecules on the affinity matrix.С целью получения каталитически активной рекомбинантной биотин лигазы (rBirA) разработан подход к получению сшитого белка MBP-BirA путем гетерологической экспрессии в клетках E. coli, с последующей его очисткой и высвобождением rBirA с помощью высокоспецифичного протеолиза TEV протеазой. Рекомбинантный белок получен в гомогенном состоянии и обладает специфической каталитической активностью. Использование иммобилизации на магнитных микрочастицах позволило разработать подход к эффективному ферментативному биотинилированию, совмещенному с очисткой целевых белковых молекул на аффинной матрице.

Субстратная специфичность рекомбинантной стероид 21-гидроксилазы человека и влияние цитохрома b5 на ее активность

Human cytochrome CYP21 (steroid 21-hydroxylase) has been expressed in Escherichia coli DH5α and the expression level was 150 nmol from 1 liter of bacterial culture. Utilizing two steps of column chromatography has allowed to obtain highly purified protein. Steroids have been screened as potential substrates for the enzyme. CYP21 showed typical spectral change (type I of spectral responce) when binding with progesterone, 17α-hydroxyprogesterone and 11-hydroxyprogesterone. In addition, it has been shown that cytochrome b5 does not affect hydroxylase activity of CYP21 toward progesterone, 17a-hydroxyprogesterone and 11-hydroxyprogesterone.Цитохром CYP21 человека (стероид 21-гидроксилаза) был экспрессирован в клетках Escherichia coli DH5α (экспрессионный уровень составил 150 нмоль белка на 1 литр культуральной среды). Использование двух последовательных колоночных хроматографий позволило получить белок высокой степени очистки, обладающий специфической 21-гидроксилазной активностью по отношению к прогестерону, 17α-гидроксипрогестерону и 11-гидрокси-прогестерону. В данной работе проводился скрининг стероидов как потенциальных субстратов для белка. Впервые доказано, что 11-гидроксипрогестерон является эндогенным субстратом CYP21. Показано, что цитохром b5, в отличие от его эффекта на CYP17A1, не оказывает влияния на 21-гидроксилазную активность CYP21 по отношению к прогестерону, 11-гидроксипрогестерону и 17-гидроксипрогестерону, что свидетельствует о разных механизмах регуляции двух изоформ цитохрома Р450 в мембранах эндоплазматического ретикулума коры надпочечников

ПЕПТИДНЫЙ ФАГОВЫЙ ДИСПЛЕЙ В СКРИНИНГЕ ПЕПТИДОМИМЕТИКОВ ТРОМБОКСАН СИНТАЗЫ

In order to identify potential inhibitors and modulators of thromboxane synthase, its molecular cloning, heterologous expression, isolation, and purification have been carried out. The recombinant protein is isolated in the homogenous state and possesses the functional activity. Peptide with an amino acids sequence SGVYKVLYDWQHGGF is identified using the random dodecapeptides phage library. It is revealed that this peptide has a great similarity to thrombopoietin peptidomimetic. This allows one to suppose the role of this hormone in the thromboxane synthase regulation.С целью поиска ингибиторов и модуляторов активности тромбоксан синтазы проведена гетерологическая экспрессия, выделение и очистка тромбоксан синтазы человека. Рекомбинантный белок получен в гомогенном состоянии и обладает функциональной активностью. С использованием фаговой библиотеки рандомизированных додекапептидов идентифицирован пептид с аминокислотной последовательностью SGVYKVLYDWQHGGF, обладающий высоким сродством к белку. Показано высокое сходство его последовательности с последовательностью пептидомиметика тромбопоэтина, что позволяет предположить роль этого гормона в регуляции активности тромбоксан синтазы