Heterologisen proteiiniekspression parantaminen kasvin lehdissä : pEAQ-HT-vektorit vertailussa tavanomaisiin binaarivektoreihin

Transientti ekspressio on suosittu tapa tuottaa proteiineja verrattuna stabiiliin ekspressioon, koska se on sopiva konstruktien nopeaan tarkasteluun. pEAQ-HT-vektorit ovat helppoja ja nopeita vektoreita ilman tarvetta virusten replikaatioon, ja ne on kehitetty transienttiin ekspressioon. Ne edistävät korkeampia ekspressiotasoja ja sallivat usean ekspressiokasetin sisällyttämisen yhteen plasmidiin. Agroinfiltraatio on laajasti käytetty metodi transientin ekspression indusoimiseen kasveissa, sillä se on tehokas ja suoraviivainen keino. Tämän tutkielman tavoitteena oli parantaa heterologista proteiiniekspressiota käyttämällä Gateway-yhteensopivia pEAQ-HT-DEST-vektoreita. Geenit G2PS1, 2 ja 3 alikloonaattiin näihin sekä pK2GW7-vektoreihin, ja infiltroitiin tupakan (Nicotiana benthamiana) lehtiin. pK2GW7-vektoreita käytettiin vertailuun tuloksia tarkastellessa western blot -analyysillä, ELISA:lla sekä HPLC:llä. Tupakan pitäisi tuottaa 6-metyyli-4-hydroksi-2-pyronia sekä 4,7-dihydroksi-5-metyylikumariinia, kun jokin näistä geeneistä on ilmentynyt, mutta molempia ei ole vielä havaittu samanaikaisesti. Korkeammat ekspressiotasot voisivat auttaa näkemään puuttuvat yhdisteet. Se olisi tärkeää tulevia tutkimuksia varten, koska jos synteesi saataisiin alkamaan infiltraation aikana, kotransformaatio reduktaasien kanssa voisi johtaa gerberiinin, parasorbosiinin ja 4-hydroksi-5-metyylikumariinin biosynteesiin, täten todistaen geenien toiminnan. Western blot -analyysi oli onnistunut ja signaali oli vahvempi kaikilla pEAQ-HT-vektoreilla verrattuna pK2GW7-vektoreihin. Seitsemän päivää infiltraation jälkeen kerätyt näytteet osoittivat vahvemman signaalin kuin kaksi päivää infiltraation jälkeen kerätyt. Vaikka kvantitatiivisia tuloksia ei saatu ELISA:sta, tuloksista kuitenkin selvästi näki pEAQ-HT-vektoreiden aikaansaavan korkeamman ekspressiotason. HPLC näytti vain 6-metyyli-4-hydroksi-2-pyronin, muttei 4,7-dihydroksi-5-metyylikumariinia. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet korkeampia ekspressiotasoja pEAQ-HT-vektoreita käyttämällä, joten voidaan todeta niiden parantavan transienttia ekspressiota verrattuna tavanomaisiin binaarivektoreihin. Vaikka pEAQ-HT-vektoreiden on todistettu toimivan tehokkaasti, on kuitenkin jo useita tutkimuksia, joissa niitä on entisestään parannettu.Transient expression is a preferred way to produce proteins compared to stable transformation because it is suitable for rapid screening of constructs. pEAQ-HT vectors are easy and quick vectors without the need for viral replication, and they are developed for transient expression. They promote high expression levels and allow the insertion of multiple expression cassettes in a single plasmid. Agroinfiltration is a widely used method to induce transient gene expression in plants because it is efficient and straightforward. This study aimed to improve heterologous protein expression using Gateway compatible pEAQ-HT-DEST vectors. The genes G2PS1, 2 and 3 were subcloned to these and pK2GW7 derived expression vectors and infiltrated into tobacco (Nicotiana benthamiana) leaves. pK2GW7 derived expression vectors were used as a reference when samples were analyzed by western blotting, ELISA and HPLC. Tobacco should produce 6-methyl-4-hydroxy-2-pyrone and 4,7-dihydroxy-5-methylcoumarin when one of these genes is expressed, but they both have not yet been observed at the same time. Higher expression levels could allow us to see that. That would be important for further studies because if the synthesis could get started under agroinfiltration, co-transformation with reductases can lead to gerberin, parasorboside and 4-hydroxy-5-methylcoumarin biosynthesis, thus proving function. Western blotting was successful and showed a stronger signal with all pEAQ-HT derived expression vectors compared to pK2GW7 derived expression vectors. Samples collected seven days after agroinfiltration showed a stronger signal than samples collected two days after infiltration. Results from ELISA also showed more protein from pEAQ-HT vectors even though quantitative data was not obtained. HPLC showed only 6-methyl-4-hydroxy-2-pyrone but not 4,7-dihydroxy-5-methylcoumarin. Previous studies have also shown increased expression using pEAQ-HT vectors. Hence, using pEAQ-HT vectors does increase transient gene expression compared to conventional binary vectors. Even though pEAQ-HT vectors are proved to work efficiently, there are already studies about improving them

Polyketide reductases in defense-related parasorboside biosynthesis in Gerbera hybrida share processing strategies with microbial polyketide synthase systems

Plant polyketides are well-known for their crucial functions in plants and their importance in the context of human health. They are synthesized by type III polyketide synthases (PKSs) and their final functional diversity is determined by post-PKS tailoring enzymes. Gerbera hybrida is rich in two defense-related polyketides: gerberin and parasorboside. Their synthesis is known to be initiated by GERBERA 2-PYRONE SYNTHASE 1 (G2PS1), but the polyketide reductases (PKRs) that determine their final structure have not yet been identified. We identified two PKR candidates in the pathway, GERBERA REDUCTASE 1 (GRED1) and GRED2. Gene expression and metabolite analysis of different gerbera tissues, cultivars, and transgenic gerbera plants, and in vitro enzyme assays, were performed for functional characterization of the enzymes. GRED1 and GRED2 catalyze the second reduction step in parasorboside biosynthesis. They reduce the proximal keto domain of the linear CoA bound intermediate before lactonization. We identified a crucial tailoring step in an important gerbera PKS pathway and show that plant polyketide biosynthesis shares processing strategies with fungi and bacteria. The two tailoring enzymes are recruited from the ancient sporopollenin biosynthetic pathway to a defense-related PKS pathway in gerbera. Our data provide an example of how plants recruit conserved genes to new functions in secondary metabolism that are important for environmental adaptation.Peer reviewe