Протеолипосомы как способ иммобилизации мембранных белков для SPR-анализа на примере взаимодействия CYP3A4 и CYB5A человека

Microsomal systems of human cytochrome P450 consist of three components, which are membrane proteins: cytochrome P450 hemoprotein (CYP), NADPH-dependent cytochrome P450 reductase (CPR), and a small regulatory heme-containing protein cytochrome b₅ (CYB5A). In the study of the cytochrome P450 system functioning the study of intermolecular interactions both with partner proteins and with possible drug prototypes is of great importance. Surface plasmon resonance (SPR) is a powerful and reliable tool for studying intermolecular interactions. However, there is a problem of immobilization of membrane proteins on the optical chip of the SPR biosensor. It is important to immobilize such proteins in native conditions with respect to the correct orientation of the protein globule to the surface of sensor. Previously, we have developed and described a method involving direct native immobilization of membrane proteins into a planar bilayer lipid membrane on the surface of a biosensor chip. At the same time, one of the commonly used approaches to working with membrane proteins using various methods is the construction of proteoliposomes containing membrane proteins. In this work, using CYP3A4 and CYB5A as protein partners, we evaluated two approaches to the creation of proteoliposomes: incorporation of a membrane protein into liposomes saturated with detergents and incorporation of a membrane protein into the forming proteoliposomes by the mechanism of micellar coalescence. The interaction of CYP3A4 with proteoliposomes obtained by incorporating CYB5A into detergent-saturated liposomes was shown. On the contrary, interaction between CYP3A4 and proteoliposomes containing CYB5A, obtained by the method of micellar coalescence, was not detected. Thus, it was shown that the incorporation of the membrane protein into liposomes saturated with a detergent was a more preferable method for working with an SPR biosensor as compared to the method of proteoliposomes formation by micellar coalescence. Detailed protocols for the creation of proteoliposomes and SPR-analysis can be useful to a wide range of researchers.Микросомальные системы цитохромов P450 человека состоят из трёх компонентов, являющихся мембранными белками: гемопротеина цитохрома P450 (CYP), NADPH-зависимой цитохром Р450 редуктазы (CPR) и небольшого регуляторного гем-содержащего белка цитохрома b₅ (CYB5A). Важным направлением в изучении системы цитохромов Р450 является исследование межмолекулярных взаимодействий как с белками-партнёрами, так и с возможными прототипами лекарств. Одним из передовых подходов к изучению межмолекулярных взаимодействий является использование метода поверхностного плазмонного резонанса (SPR). При этом возникает проблема иммобилизации мембранных белков на оптический чип SPR-биосенсора. Для моделирования нативных условий важное значение имеет соблюдение правильной ориентации белковой глобулы в пространстве. Ранее нами был разработан метод, предполагающий прямую иммобилизацию нативных мембранных белков в планарную бислойную липидную мембрану на поверхности чипа биосенсора. Другим широко распространённым подходом для работы с мембранными белками является конструирование протеолипосом, содержащих мембранные белки. В данной работе нами на примере белковых партнёров CYP3A4 и CYB5A было проведено сравнение двух подходов создания протеолипосом для SPR-анализа межмолекулярных взаимодействий мембранных белков: встраивание мембранного белка в липосомы, насыщенные детергентом, и встраивание мембранного белка в формирующиеся протеолипосомы по механизму мицеллярной коалесценции. SPR-анализ показал взаимодействие CYP3A4 с протеолипосомами, полученными методом встраивания CYB5A в липосомы, насыщенные детергентом. Факт взаимодействия между CYP3A4 и полученными методом мицеллярной коалесценции протеолипосомами, содержащими CYB5A, зафиксировать не удалось. Полученные результаты показали, что встраивание мембранного белка в липосомы, насыщенные детергентом, является более предпочтительным методом для работы с SPR-биосенсором по сравнению с методом формирования протеолипосом мицеллярной коалесценцией. Приведенные подробные протоколы создания протеолипосом и SPR-анализа могут быть полезны широкому кругу исследователей