変異原性環境化学物質、ニトロ多環芳香族炭化水素類の人体曝露評価法の開発

金沢大学医薬保健研究域薬学系多環芳香族炭化水素(PAH)は、化石燃料の燃焼過程で生成する非意図的生成物であり、自動車やタバコなどを排出源として環境中に放出されるPAHは、燃焼時もしくは大気中で窒素酸化物と反応して極めて強い発ガン性・変異原性を有するニトロ多環芳香族炭化水素(NPAH)を生成するNPAHのヒトや動物への暴露量は高いと予測され、その大気内挙動や季節変動、都市のエネルギー・交通事情との関係等が明らかになりつつあるが、ヒトに対するリスク評価(健康影響評価)が急務となっている。そこで本研究では、NPAHのヒトに対する曝露量を評価するためのバイオマーカーの開発を行うにあたり、指標の候補となるNPAHの尿中代謝物を同定した。NPAHの中で大気粉塵やディーゼル排ガス粉塵に高濃度で存在する1-ニトロピレン(1-NP)に着目し、まず代謝物として考えられるヒドロキシ-1-ニトロピレン(OH-1-NP)を合成した。尿中代謝物として存在するOH-1-NPを定量するためには、より高感度な分析法の開発が要求された。そこでOH-1-NPを逆相カラムで分離した後、オンライン白金/ロジウムカラムにより効率よく蛍光性のアミノ体に還元してその蛍光を検出することによりOH-1-NPを高感度に測定するHPLC-蛍光検出法を開発した。次に尿試料の前処理法を検討し、抱合体として存在するOH-1-NPを酵素で加水分解した後、逆相系と順相系の固相抽出カラムを組み合わせること夾雑ピークを効率よく除去することに成功した。実際にヒトの尿試料を用いてOH-1-NPの同定を試みたところ、OH-1-NPのピークを確認することができ、さらにそのピークを分取してLC-MSで測定したところ、その分子量関連イオンピークを観察することができた。開発したヒト尿中OH-1-NPの分析法は、NPAHの曝露量の有用な指標(バイオマーカー)となる可能性が高い。研究課題/領域番号:15790077, 研究期間(年度):2003 – 2004出典：「変異原性環境化学物質、ニトロ多環芳香族炭化水素類の人体曝露評価法の開発」研究成果報告書　課題番号15790077（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-15790077/)を加工して作

ベンゾ[a]ピレン及びその代謝物の内分泌撹乱作用の評価法に関する研究

ベンゾ[a]ピレン(BaP)をはじめとする多環芳香族炭化水素類(PAH)の内分泌撹乱作用は,抗エストロゲン作用などの一部の作用のみが報告されるにとどまっていることから,PAH及び類縁化合物の内泌撹乱作用を評価した。BaPを含むいくつかのPAHに抗エストロゲンあるいは抗アンドロゲン作用が観察され,その作用はアリル炭化水素受容体を介して発現することが推定された。また,BaPの代謝物として知られるBaPモノヒドロキシ体(OHBaPs)がエストロゲン様/抗エストロゲン活性を示したが,ジオール体及びキノン体は活性を示さなかった。このことから,フェノール性水酸基の存在が活性発現に必須であるだけでなく,水酸基の位置も重要な要因であることが明らかとなり,BaPが生体内で代謝されることで新たな内分泌撹乱作用を獲得することが示唆された。 次に,BaPをはじめとするPAHの内分泌撹乱作用のヒトに対するリスク評価を行うにあたり,PAH曝露量を評価するための2つの手法を検討した。まず地域別の大気粉じん中PAH濃度を測定し,呼吸を介したPAH曝露の推定を試みた。その結果,PAH曝露量は都市域で高く,さらに地域のエネルギー事情を強く反映することが分かった。しかしながら,個人のPAH曝露量はPAHの摂取源の一つである喫煙などの生活習慣によっても異なってくることから,尿中代謝物量を指標とするPAH曝露量の推定を試みた。まず,BaPをシトクロムP450によりin vitroで代謝させたときに生成するBaP代謝物としての1-OH,3-OH,及び9-OHBaPを同定した。さらに尿中OHBaPs、及びPAH曝露の指標としての1-ヒドロキシピレン(1-OHP)と2-ヒドロキシフルオレン(2-OHF)についてのHPLC-蛍光検出法による分析法を開発し,ヒトの尿中代謝物を測定した結果,OHBaPsの異性体の中でエストロゲン様活性を有する3-OHBaPを検出した。また1-OHP及び2-OHFについては,PAH摂取源の一つである喫煙の影響を検討したところ,喫煙者でそれらの尿中濃度が有意に高く,PAHの曝露指標になることが分かった。以上の結果から、内分泌撹乱作用を有するPAH代謝物が生体内で生成することを確認するとともに,尿中PAH代謝物量が個人のPAH曝露量を反映した,優れた指標となることが明らかとなった。Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) such as benzo[a]pyrene (BaP) have been reported for their endocrine-disrupting activities, primarily their antiestrogenic characteristics. In this study, the endocrine-disrupting activities of PAHs and their analogues (metabolites) were investigated. Several PAHs containing BaP exhibited the antiestrogenic and antiandrogenic effects and it was suggested that the PAHs act as antiestrogens and antiandrogens by activating the aryl hydrocarbon receptor (AhR). On the other hand, the estrogenic and antiestrogenic effects of the BaP metabolites were also examined. Monohydroxy derivatives of BaP (OHBaPs) exhibited the estrogenic or antiestrogenic effects, diol and quinone derivatives of BaP did not. Therefore, the presence and position of phenolic hydroxy group in the BaP metabolites play an important role in the induction of the endocrine-disrupting activities.Two methods for the evaluation of PAH exposure were developed to assess a human risk of the en docrine-disrupting effects for PAHs and their metabolites. To evaluate the exposure to PAHs from ambient air by inhalation, the atmospheric concentrations of PAHs were measured with the airborne particulates collected in three cities. The concentrations of PAHs, that is, the exposure dose were much higher in urban area than in suburban area, and the main contributors of PAHs in urban area were considered to be automobiles, domestic heating systems such as furnaces and kerosene heaters, power plants and incinerators. However, the intake of PAHs depends on individual lifestyle such as diet and tobacco smoke, therefore, biomonitoring is an especially valuable method to provide exposure data of PAHs. Urinary metabolites of PAHs including BaP were used as PAH biomarkers. 1-, 3-, 9-OHBaPs were identified as major metabolites of BaP in vitro by human recombinant cytochrome P450. The methods for determining OHBaPs, 1-hydroxypyrene (1-OHP) and 2-hydroxyfluorene (2-OHF) using high-performance liquid chromatography with fluorescence detection were developed. 3-OHBaP, which has a particularly high estrogenic activity, was detected in the urine of a subject. Further, the effect of smoking on the exposure to PAHs was investigated using the concentrations of urinary 1-OHP and 2-OHF. The urinary 1-OHP and 2-OHF levels in smokers were significantly higher than those in non-smokers. Thus, urinary metabolites of PAHs may be sensitive and specific biomarkers for the assessment of the exposure to PAHs.研究課題/領域番号:13558066, 研究期間(年度):2001–2002出典：「ベンゾ[a]ピレン及びその代謝物の内分泌撹乱作用の評価法に関する研究」研究成果報告書　課題番号13558066 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作

多環芳香族炭化水素類(PAHs)のホルモン活性等価係数(HAEF)の確立

金沢大学医薬保健研究域薬学系多環芳香族炭化水素類(PAHs)は、化石燃料に含まれ、また燃焼過程で生成する非意図的生成物であり、自動車やタバコなどを排出源として環境中に放出されるため、ヒトや動物の曝露量は高い。PAHsは、内分泌撹乱物質の一つとして疑いが持たれているものの、ヒトに対するリスク評価は十分ではない。昨年度の研究により、PAH関連化合物のエストロゲン様/抗エストロゲン作用を酵母two-hybrid法を用いて測定した結果、モノヒドロキシ体が特に強い活性を有することを見出した。そこで本年度は、様々な骨格を有するPAHモノヒドロキシ体のERに対するアゴニスト及びアンタゴニスト作用と構造との関係を考察し、活性発現に影響する因子の推定を行った。まずエストロゲン様/抗エストロゲン活性を示すPAHモノヒドロキシ体の多くは4環構造を有し、同じ環数を有していても母核構造や水酸基の位置が異なることによって発現する活性の種類やその強さが異なることが分かった。また、母核構造の違いを表すL/B比と水酸基の位置の違いを表すO-H distanceを用いて活性を有する化合物の分子構造を評価し、各パラメータ値がそれぞれ特定の範囲を満たす化合物が強いエストロゲン様/抗エストロゲン活性を示す傾向にあることを明らかとした。さらにCACheを用いたコンピューターシミュレーション解析によって算出されたフェノール性水酸基の酸素原子の部分電荷が活性発現に寄与することを確認した。環境試料のヒトに対する内分泌撹乱作用のリスク評価を行う上でエストロゲン様/抗エストロゲン活性を活性等価係数として表すことは必要不可欠であると考えられ、本研究で得られた活性値を基にPAHモノヒドロキシ体の活性等価係数を算出することが可能となった。また一方で、タバコ煙や大気粉塵抽出物などの環境試料中にPAHモノヒドロキシ体が存在することも確認できた。研究課題/領域番号:14042219, 研究期間(年度):2002 – 2003出典：「多環芳香族炭化水素類(PAHs)のホルモン活性等価係数(HAEF)の確立」研究成果報告書　課題番号14042219（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-14042219/)を加工して作

多環芳香族炭化水素類(PAH)-DNA付加体を指標とするPAH曝露評価法の開発

金沢大学医薬保健研究域薬学系多環芳香族炭化水素(PAH)のなかで特に強い発がん作用を有するBenzo[a]pyrene(BaP)に着目し、BaPが代謝活性化されて生成する発がん作用の本体であるBaP-DNA付加体を生体指標(バイオマーカー)として用いるために、BaP-DNA付加体の高速液体クロマトグラフ-タンデム質量分析計(LC-MS/MS)を用いた新しい高感度分析法の開発を試みた。DNA付加体関連物質としてdG-BPDE、及びdG-BPDEを加水分解して得られるBaP tetrolをBaP-DNA付加体の分析対象化合物としてLC-MS/MSの条件検討を行った。分子量関連イオンをプリカーサーイオンとしてdG-BPDEのMS/MSスペクトルを得たところ、グアニン残基が脱離したイオンが観察され、このイオンを効率よく生成させるように、移動相条件、電圧等を最適化した。これに順じてBaP tetrolのLC-MS/MS条件を最適化するとともに、蛍光検出HPLCによる分析法も確立した。確立した分析法を培養細胞にBaPを暴露して得られたDNAに適用したところ、発がん作用の本体として知られる代謝生成物のanti-BPDEに由来するBaP-DNA付加体をBaP tetrolとして検出することができた。細胞のBaP処理24時間後からBPDE-DNA付加体が観察され、処理時間に依存して付加体量の増加が見られた。続いてDNA付加体を利用したヒトの曝露評価を行うためのバイオマーカーの開発を行った。被験者への負担(侵襲性)の観点から尿中のBaP-DNA付加体関連物質をバイオマーカー候補として、DNA付加体を加水分解して得られる尿中tetrolの検出を試みたが、前処理法の回収率の低さなどの改善の余地が残った。研究課題/領域番号:17659036, 研究期間(年度):2005 – 2006出典：「多環芳香族炭化水素類(PAH)-DNA付加体を指標とするPAH曝露評価法の開発」研究成果報告書　課題番号17659036（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-17659036/)を加工して作

Differentical Effects of PAHs and PAHs-Quinone on Oxidative Stress Damage in A549 Cells

金沢大学大学院自然科学研究科Promoting Environmental Pesearch in Pan-Japan Sea Area : Young Researchers\u27 Network, Schedule: March 8-10,2006,Kanazawa Excel Hotel Tokyu, Japan, Organized by: Kanazawa University 21st-Century COE Program, Environmental Monitoring and Prediction of Long- & Short- Term Dynamics of Pan-Japan Sea Area ; IICRC(Ishikawa International Cooperation Research Centre), Sponsors : Japan Sea Research ; UNU-IAS(United Nations University Institute of Advanced Studies)+Ishikawa Prefecture Government ; City of Kanazaw

Antiandrogenic activity of diesel exhaust particulates

金沢大学大学院自然科学研究科Proceeding : International Symposium of Kanazawa University 21st-Century COE Program Vol.2(2004),Schedule: February 29(SUN)-March 3(WED), Venue: 29 FEB, Ishikawa Life-Long Learning Center(Former Prefectural Government Building) / 1-3 MAR Kanazawa Art Hall, Organized by: Kanazawa University 21st-Century COE Program / Ishikawa International Cooperation Research Centre / United Nations University-Institute of Advanced Studies, Supported by: Ishikawa Prefectural Government / City of Kanazawa, Eds : Hayakawa, Kazuichi / Kizu, Ryoichi / Kamata, Naok

Use of biomarkers in the assessment of exposure to polysyclic aromatic hydrocarbons

金沢大学大学院自然科学研究科Proceeding : International Symposium of Kanazawa University 21st-Century COE Program Vol.2(2004),Schedule: February 29(SUN)-March 3(WED), Venue: 29 FEB, Ishikawa Life-Long Learning Center(Former Prefectural Government Building) / 1-3 MAR Kanazawa Art Hall, Organized by: Kanazawa University 21st-Century COE Program / Ishikawa International Cooperation Research Centre / United Nations University-Institute of Advanced Studies, Supported by: Ishikawa Prefectural Government / City of Kanazawa, Eds : Hayakawa, Kazuichi / Kizu, Ryoichi / Kamata, Naok

An analytical method for measuring α-amylase activity in starch-containing foods

The quality of starch-containing foods may be significantly impaired by contamination with very small amounts of α-amylase, which can enzymatically hydrolyze the starch and cause viscosity loss. Thus, for quality control, it is necessary to have an analytical method that can measure low amylase activity. We developed a sensitive analytical method for measuring the activity of α-amylase (from Bacillus subtilis) in starch-containing foods. The method consists of six steps: (1) crude extraction of α-amylase by centrifugation and filtration; (2) α-amylase purification by desalting and anion-exchange chromatography; (3) reaction of the purified amylase with boron-dipyrromethene (BODIPY)-labeled substrate, which releases a fluorescent fragment upon digestion of the substrate, thus avoiding interference from starch derivatives in the sample; (4) stopping the reaction with acetonitrile; (5) reversed-phase solid-phase extraction of the fluorescent substrate to remove contaminating dye and impurities; and (6) separation and measurement of BODIPY fluorescence by HPLC. The proposed method could quantify α-amylase activities as low as 10mU/mL, which is enough to reduce the viscosity of starch-containing foods. © 2012 John Wiley & Sons, Ltd

An environmental quinoid polycyclic aromatic hydrocarbon, acenaphthenequinone(AcQ), modulates COX-2 expression through ROS generation and NF-kB activation in A549 cells

金沢大学大学院自然科学研究科場所：金沢大学自然科学研究科図書館棟1階，講演会場：図書館棟1階　大会議室，ポスター会場：図書館棟1階12会議室,主催・共催：文部科学省２１世紀COE「環日本海域の環境計測と長期・短期変動予測」， 大気環境学会， 金沢大学工学

Determination of 1-nitropyrene in low volume ambient air samples by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection

金沢大学医薬保健研究域薬学系To measure the actual exposure of a person to 1-nitropyrene (1-NP) in airborne particulate matter, it is considered more accurate to collect air samples with a portable air sampler than to sample at a fixed location. However, because the portable samplers can sample only small volumes, a sensitive method is needed to analyze the compounds that are collected on a filter. Here we describe a high-performance liquid chromatographic (HPLC) method with fluorescence detection that is sensitive and precise enough for use with portable air samplers. The developed column-switching system successfully removed the interfering substances in the samples with only a simple pretreatment. To improve the precision of the measurement, deuterated 1-NP was used as an internal standard, and it eluted immediately prior to 1-NP with sufficient resolution (Rs, 1.50). The detection limit was 0.32 fmol/injection, and the calibration range was from 2 to 100 fmol. The proposed method was applied to determining 1-NP in fine airborne particulate matter (PM2.5) at two sites with low pollution levels. 1-NP was detected in all samples at concentrations in the low fmol/m3 range. The proposed method has enough sensitivity and precision to determine 1-NP in the limited air volume of the portable sampler. © 2009 Elsevier B.V. All rights reserved