肉腫に対する制癌剤の耐性克服に関する研究

金沢大学医学部・助教授ヒト肉腫培養細胞を用いたHuman Tumor Clonogenic Assay(HTCA)において制癌剤とカフェインの1時間同時投与は相乗効果を認めず、制癌剤1時間投与後よりカフェインを持続接触とした場合に著明な相乗効果を認めた。ヒト肉腫新鮮材料を用いたHTCAでは、シスプラチン、マイトマイシンC、サイクロフォスファマイド及びアドリアマイシンの4種類のDNA合成阻害作用を示す制癌剤とカフェインが相乗効果を認め、特にシスプラチンとカフェインの併用は有効であった。単層培養系を用いたシスプラチンとカフェインの併用効果の検討では、腫瘍倍加時間を経過した時点から肉腫培養細胞に対する殺細胞効果あるいは増殖抑制効果が著明に増強し、かつ細胞回転上の変動としてS期及びG^2/M期の蓄積が解除された。また、ヌ-ドマウス法において、カフェインはシスプラチンの抗腫瘍効果を著明に増強し、かつ治療効果判定日における体重及び脾臓重量は、カフェインとシスプラチンの併用投与群と対照群との間に有意差を認めなかった。以上、カフェインはDNA合成阻害作用を有する制癌剤の効果を増強することから、肉腫に対する化学療法の限界を打破する有用な効果増強補助剤である可能性が示唆された。In this study the combined effect of anticancer agents and caffeine, which inhibits DNA repair, on human sarcomas was examined with various assay techniques. In human tumor clonogenic assay, the combined use of caffeine produced synergistic effects with four DNA-damaging agents (cisplatin, mitomycin C, cyclophosphamide and adriamycin). Particularly by the combination of cisplatin with caffeine, marked synergistic effects were observed in 14 out of 18 specimens (78%) of fresh human tumor specimens. Caffeine markedly increased the cytocidal effect of cisplatin following mitosis. At this time, the accumulation of S and G2/M phase was reduced on the DNA histogram, and nuclear fragmentations of tumor cells were frequently observed. In assay, using athymic mice, the combination of caffeine and cisplatin showed prominent antitumor effect without significant toxicity. These findings suggest the possibility that caffeine could be a useful drug capable of overcoming drug resistance to sarcomas, as caffeine enhanced the effect of DNA-damaging agents.研究課題/領域番号:62570680, 研究期間(年度):1987 – 1988出典：研究課題「肉腫に対する制癌剤の耐性克服に関する研究」課題番号62570680（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-62570680/625706801989kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作

生体骨における力学的刺激とリモデリング機構に関する研究

金沢大学医学部力学的刺激が骨の形成や吸収に関与していることは、これまでの研究で明らかにされている。しかし力学的刺激の大きさ及び種類との関係については、未だ不明な点が多い。本研究ではこれを明らかにするため、家兎脛骨に圧縮及び引張応力を与え、その際生じるひずみを3次元有限要素法により解析し、これと骨形成を組織学的に比較検討している。実験動物には日本白色ウサギを用い、右脛骨の近位端、遠位端に70mmの間隔をあけて各々1本ずつ径2mmのステンレス製ピンを刺入し、2本のピンの中点に径3mmの円孔を作成し、この2本のピンを介して圧縮または引張荷重を1日1時間、荷重量5kgf、周期0.5Hzで間欠的に与えることにした。そのために一定の荷重量を正確に繰り返して与えることができるように自動制御可能な荷重刺激装置を製作した。装置の性能評価実験を行ない、荷重が繰り返されるのに伴って生じるピン刺入部の弛みや試料の特性の変化に対応して一定の荷重量が与えられることを確認した。実験開始後1週、2週、4週で脛骨を摘出し、円孔周辺における骨形成を組織学的に評価した。圧縮刺激群、引張刺激群、対照群の3群につき比較検討した。その結果、実験開始後1週間では圧縮刺激群、引張刺激群、対照群ともに骨形成はみられなかった。2週間では圧縮刺激群、引張刺激群ではともにひずみの大きさが300μstrain以上の部位に未熟骨の形成を認めた。対照群で骨形成は認めなかった。4週間では2週間の圧縮刺激群、引張刺激群でみられた未熟骨は成熟した骨梁となり、円孔の中円に向かい骨形成が進行していた。対照群では未熟骨の形成を認めたが発生部位は一定でなかった。以上の結果より300μstrain以上の圧縮ひずみ、引張ひずみはともに骨形成を促進するという傾向が得られた。研究課題/領域番号:04237212, 研究期間(年度):1992出典：研究課題「生体骨における力学的刺激とリモデリング機構に関する研究」課題番号04237212（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-04237212/）を加工して作

ヒト骨肉腫に対するビタミンD_3の抗腫瘍効果ならびに分化誘導効果の検討

金沢大学医学部これまでにヒト骨肉腫細胞株 OST、ラット骨肉腫細胞株ROS17/2.8及びマウス骨肉腫細胞株POS-1に対するビタミンD_3の抗腫瘍効果、及び骨芽細胞の表現形質をマーカーとした分化誘導効果を検討し、1a、25(OH)_2D_3が濃度依存性に増殖抑制効果を認め、ALP活性、BGP量の増加作用も認められることを示してきた。またヌードマウスへ1a、25(OH)_2D_3のmasked compoundである1a(OH)D_3を2.5nmol/kg隔日腹腔内投与にて増殖抑制効果を認め、OSTにおいては治療群で広範な軟骨形成を認めた。今回さらにヒト骨肉腫細胞株と臨床材料に対するビタミンD_3の抗腫瘍効果ならびに分化誘導効果のメカニズムを検討するにあたり、骨肉腫内ビタミンD_3リセプターの定量を行った。ヒト骨肉腫培養細胞株であるMG63、OST、MNNG-HOS、KHOS-npのリセプター量はそれぞれ31.08、12.12、6.36、2.99fmo1/mgであった。さらにそれぞれの細胞株の増殖抑制効果をみるためにColony forming assayを行うと、リセプターの豊富なMG63においてリセプターの豊富なROS17/2.8と同様に増殖抑制効果を認めたが、リセプターの少ないMNNG-HOS、KHOS-npでもある程度の増殖抑制効果を認めた。さらにヌードマウス法においてリセプターの豊富なMG63とリセプターの少ないMNNG-HOSとを背部皮下に移植して1a(OH)D_3の腹腔内投与による影響を調べようとしたがMG63が可植されず、逆にMNNG-HOSにおいて増殖抑制効果を認めてしまった。現在はMatrigelにて可植率が上昇するという報告に従いMG63+Matrigelにて移植を試みている。またALP活性も有意な結果がでず、FBSの濃度を変えたり、Ascorbic acidを加えたりして行っている。今後は本当にリセプターの差異で増殖抑制効果が変わるのか、他のメカニズムが存在するのかを探求していく予定である。研究課題/領域番号:03454357, 研究期間(年度):1991 – 1992出典：研究課題「ヒト骨肉腫に対するビタミンD_3の抗腫瘍効果ならびに分化誘導効果の検討」課題番号03454357（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-03454357/）を加工して作

マウスにおける脊椎転移モデルの確立とその発育、進展過程の組織学的解析

金沢大学医学部培養細胞には金沢大学癌研究所化学療法部から供与されたmurine melanoma cell,B16/F10を用いた。C57/BL/6Nマウスの6-8週齢の雌をネンブタールにて麻酔し、27ゲージの針にて、2X10^6個の細胞を左心室に注入した。腫瘍細胞注入後、1週目、2週目に各5匹づつ屠殺し、全身灌流後、10%ホルマリン液にて灌流固定した。脱灰後HE染色にて脊椎正中矢状面の切片を顕微鏡下に観察した。同種正常マウス5匹を対照に用いた。細胞注入後、1週目には、5匹中1匹(5椎骨)に脊椎転移巣を認めた。腫瘍細胞の局在は、椎体上下の軟骨板に接する部位を中心に存在していた。しかし、椎体から脊柱管に腫瘍細胞が進展している像は観察されなかった。2週目においては、病理学的には5匹全例に脊椎転移巣を認め、合計52椎骨、1匹平均10.4椎骨に転移腫瘍細胞が存在していた。また5匹中1匹に下肢麻痺が生じた。21椎骨において、転移腫瘍細胞が硬膜外腔に進展し、脊髄前方、後方、もしくはその両側より脊髄を圧迫していた。硬膜外腔での上下方向の腫瘍進展範囲は1椎体以内のものが10部位、1椎体以上2椎体以内のものが10部位、4椎体に及んだものが1部位であった。このなかで4椎体のレベルにまで上下方向に腫瘍進展を認めた1部位で、腫瘍細胞は硬膜を破壊し脊髄内に直接浸潤していた。しかし他の20部位において硬膜は腫瘍の進展を完全に阻止し、脊髄内への直接浸潤は認めなかった。左心室に腫瘍細胞を注入することにより、脊椎転移モデルの作製が可能であった。特に硬膜外腔に進展した腫瘍細胞は硬膜外腔を上下方向に進展するが、硬膜内浸潤は稀であり、硬膜がバリアー効果を発揮していたことが観察された。しかし範囲が多椎体(4椎体以上)に及ぶときは、腫瘍が硬膜を破壊し、硬膜外直接浸潤の可能性もあることが証明された。研究課題/領域番号:08671647, 研究期間(年度):1996出典：研究課題「マウスにおける脊椎転移モデルの確立とその発育、進展過程の組織学的解析」課題番号08671647（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-08671647/）を加工して作

アダムキュービッツ動脈高位を含む分節動脈結紮による脊髄血流および機能に関する研究

金沢大学医学系当科では原発性の脊椎悪性腫瘍や脊椎転移癌に対し腫瘍脊椎骨全摘術(高度先進医療)を行っている。術前の脊椎分節動脈塞栓術により術中出血量を明らかに減少させることができ、この術式では術中の脊椎分節動脈の結紮が必要になる。本研究の目的は、胸腰髄の主要栄養血管であるAdamkiewicz動脈の高位において、両側何対の脊椎分節動脈の結紮が虚血性脊髄障害を引き起こしうるかを脊髄血流量の変化と脊髄機能を評価して検討することである。本研究では各実験後に動脈造影を行い、第5腰髄(L5)高位にAdamkiewicz動脈が存在した犬のみを対象として採用した。前年度は、Adamkiewicz動脈高位を含んだ両側1対から4対までの分節動脈の結紮を行った後に結紮後10時間まで脊髄血流量の測定と脊髄モニタリングを行い、4対結紮群における3匹中1匹に脊髄モニタリングで異常値を認めた。(実験1)この結果を受けて、今年度は別の犬を用いて、両側3対(L4-6:n=5)、両側4対(L3-6:n=5)結紮群における術後1週間の後肢運動機能を評価した。その結果、両側3対結紮群の5匹はすべて正常だったのに対し、両側4対結紮群の5匹中1匹の後肢・尾に不全麻痺を認めた。(実験2)以上の結紮後の脊髄血流測定と脊髄モニタリングを用いた脊髄機能評価を行った実験1と、術後の後脚の運動機能を評価した実験2から、犬におけるAdamkiewicz動脈の高位を含んだ4対以上の両側分節動脈の結紮は虚血性脊髄障害を生じる可能性が示唆された。研究課題/領域番号:20591740, 研究期間(年度):2008 – 2010出典：研究課題「アダムキュービッツ動脈高位を含む分節動脈結紮による脊髄血流および機能に関する研究」課題番号20591740（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-20591740/）を加工して作

骨軟部悪性腫瘍における in vitro colony assay に関する研究

金沢大学医学部研究課題/領域番号60570692, 研究期間(年度):1985出典：研究課題「骨軟部悪性腫瘍における in vitro colony assay に関する研究」課題番号60570692（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-60570692/）を加工して作

骨軟部腫瘍に対するMTT assayに関する研究

金沢大学医学部本研究はMTT assayを骨軟部悪性腫瘍に対する抗癌剤感受性試験として応用し、その実用性を検討する目的で行った。まず、11種のヒト骨肉腫由来培養細胞株を用いて基礎的検討を行った。各細胞株において溶解されたホルマザン塩の吸光度と細胞数は良好な相関関係を示した。これらの細胞株に対して最大血中濃度においてはアクチノマイシンD、アドリアマイシン、シスプラチン、メソトレキセ-ト、ビンクリスチン、サイクロフォスファミドが高い有効率を示した。最大血中濃度の10分の1においては、これら薬剤も有効率は低かった。これらの薬剤は骨肉腫に有効とされており最大血中濃度における効果判定が適当であると考えられた。また骨肉腫に対する有効性が報告されていないエトポサイドがいずれの細胞株に対しても高い効果を示し、骨肉腫に対する有効性が示唆された。これらの細胞株に対する基礎的検討の結果をふまえて、臨床材料に対してMTT assayを用いた抗癌剤感受性試験を行った。2年間に手術または生検により得られた骨軟部悪性腫瘍67検体を用いた。67検体中64検体(96%)に感受性判定が可能であった。1×10^4個以上を播種した検体は全て判定可能であった。感受性判定が可能であった薬剤数は平均8.4剤であった。30検体について臨床効果との関連性を前向き研究および後向き研究によって検討し得た。MTT assayを用いた感受性試験の結果と臨床効果との相関は、真陽性が15検体、偽陽性が2検体、真陰性が10検体、偽陽性が3検体であり、真陽性率が88%、真陰性率が77%で、全体的な予測率は83%であった。本法は簡便、迅速で少ない材料で多数の薬剤の感受性を判定できる。また成功率も高く臨床効果との相関も高いことが示された。以上、本研究によりMTT assayを用いた感受性試験は骨軟部悪性腫瘍に対する実用的な抗癌剤感受性試験になりうるものと考えられた。The present study was performed to examine practicality of the MTT assay as chemosensitivity test for bone and soft tissue sarcomas. In eleven human osteosarcoma cell lines, the absorbance of the solubilized formazan was found to be directly proportional to the number of cells. On cell lines, effective drugs at the peak plasma concentration were actinomycin-D, adriamycin, cis-platinum, methotrexate, cyclophosphamide, vincristine. However, at 1/10 peak plasma concentration, these drugs were not effective. These drugs had been reported their efficacy against osteosarcoma. Therefore, it was suggested that the evaluation at peak plasma concentration was appropriate. Etoposide also showed high efficacy rate for cell lines, it would be a candidate for chemotherapy of osteosarcoma. On the basis of experimental results on cell lines, chemosensitivity test using the MTT assay for clinical specimens were performed. Sixty seven specimens of bone and soft tissue sarcomas obtained by surgery or biopsy were used. Of the 67 specimens, sixty four (96%) gave technically successful assay results. All cases seeded over 1X10^4 cell/well were successful. The number of drugs tested in successful specimens were 8.4 (mean). Thirty cases were clinically evaluated prospectively or retrospectively. The relationship between this assay and clinical response was 15 true positives, 2 false positives, 10 true negatives and 3 false negatives. True positive rate was 88%, true negative rate was 77%, and overall predictive accuracy was 83%. In this assay, many samples and anticancer drugs can be analyzed simply and rapidly. A high success rate and a high predictive accuracy of this assay were also showed in this study. Therefore, the MTT assay would be a practical chemosensitivity test for the treatment of bone and soft tissue sarcomas.研究課題/領域番号:01480365, 研究期間(年度):1989 – 1990出典：研究課題「骨軟部腫瘍に対するMTT assayに関する研究」課題番号01480365（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-01480365/014803651990kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作

骨軟部悪性腫瘍における in vitro colony assay に関する研究

金沢大学医学部研究課題/領域番号59570633, 研究期間(年度):1984出典：研究課題「骨軟部悪性腫瘍における in vitro colony assay に関する研究」課題番号59570633（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-59570633/）を加工して作

Percutaneous screw fixation without bone graft for cystic-type scaphoid fractures

金沢医療センター整形外科金沢大学医薬保健研究域医学系BACKGROUND:: The most controversial problem in treating scaphoid fractures is whether bone grafts are necessary for cystic-type fractures. METHODS:: We treated 105 scaphoid fractures using Herbert screws (1988-1997), AO 3.0 mm cannulated screws (1998-2002), and Acutrak screws (2003-2006). The patients ranged in age from 14 years to 67 years (average, 26 years). Our classifications were based on the radiographic findings: linear type (51 cases); cystic type (24 cases); and sclerotic or displaced type (30 cases). Linear and cystic types did not have any displacement more than 2 mm. If the fracture line had a sclerotic zone thicker than 1 mm, it was classified as sclerotic or displaced. The length of time before surgery did not affect the classification. Osteosynthesis was performed-without bone graft in all linear cases, with a bone graft in 7 and without a bone graft in 17 cases in cystic type, and with all bone graft in sclerotic or displaced type. RESULTS:: Bone union was achieved in all cases in linear type. There were one failure (AO) in 7 cases with bone graft and 3 failures (1 Herbert and 2 AO) in 17 cases without bone graft in cystic type. All 10 cases achieved bone union without bone graft in cystic type using Acutrak screw. There were two failure cases (2 AO) in sclerotic or displaced type. CONCLUSIONS:: Screw fixation without bone graft using Acutrak screws was a reliable strategy for the treatment of cystic-type scaphoid fractures. © 2008 by Lippincott Williams & Wilkins

生体骨における力学的刺激と骨形成の関係,及びその理論モデルに関する研究

金沢大学医学部力学的刺激が骨の形成や吸収に関与していることは,これまでの研究で明らかにされているが力学的刺激の大きさ及び種類との関係については,未だ不明な点た多い.これを明らかにすることが本研究の目的である.動物実験には日本白色ウサギを用い,右脛骨の近位端,遠位端に70mmの間隔をあけて1本ずつピンを刺入し,2本のピンの中点に径3mmの円孔を作成した.平成4年度に作製した荷重刺激装置を用い,ピンを介して圧縮または引張荷重を1日1時間,荷重量49N,周期0.5Hzで間欠的に与えた.圧縮刺激群,引張刺激群,対照群の3群につき,それぞれ1週,2週,4週群を設定し,各群とも5羽とした.骨形成量の定量化は画像解析処理ソフトウエアにて行った.円孔周囲に作用する力学的刺激量として有効応力を3D-FEMにより求めた.前年度までに圧縮刺激群,引張刺激群のいずれにおいても0〜4.1(MPa)の有効応力が生じた部位よりも2.7〜10.8(MPa)の有効応力が生じた部位に有意に多くの未熟骨の形成を認めており,圧縮ひずみ,引張ひずみはともに骨形成を促進し,骨形成量はひずみの大きさに依存することが確認されている.本年度は実験動物にテトラサイクリンを投与し,円孔周囲の骨研磨標本を作成した.新生骨に一致してテトラサイクリンによる標識を認めた.第2次骨単位には対照群ではテトラサイクリンによるリングを認めたが圧縮刺激群,引張刺激群ではリングは認められなかった.力学的刺激を与えない骨ではturn-overの促進を伴った骨粗鬆化が生じており,圧縮刺激,引張刺激により骨粗鬆化が防止されると考えられた.また今回Beaupreらの骨再構築理論を本実験に適用し,円孔における骨形成をコンピュータによりシミュレーションを行った.シミュレーションの結果は実験結果とほぼ一致しており,この理論の有効性が確認された.研究課題/領域番号:06213217, 研究期間(年度):1994出典：研究課題「生体骨における力学的刺激と骨形成の関係,及びその理論モデルに関する研究」課題番号06213217（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-06213217/）を加工して作