Transportin-SR2 and HIV-1: the road to the nucleus

Het humaan immuundeficiëntievirus (HIV) is de oorzaak van het verworven immuundeficiëntiesyndroom (AIDS). Sinds de ontdekking van HIV in 1981 zijn er meer dan 25 miljoen mensen gestorven aan AIDS. Aan het einde van 2008 leefden er naar schatting 33.4 miljoen mensen wereldwijd met AIDS en vonden naar schatting 2.7 miljoen nieuwe infecties plaats. Afrika alleen heeft 14 miljoen weeskinderen ten gevolge van AIDS. De huidige HIV therapie is een combinatietherapie van middelen die verschillende stappen in de virale replicatiecyclus als doelwit hebben. Deze stappen zijn het binnendringen in de doelwitcel, reverse transcriptie van het virale RNA genoom, de integratie van het provirale DNA in het chromatine van de gastheercel, en de proteolytische klieving van virale polyproteïnen tijdens de maturatie van virale partikels. Combinatietherapie is in staat om de virale replicatie in geïnfecteerde personen te controleren tot onder het niveau van detectie. Echter, het ontstaan van multiresistente virale stammen dwingt ons tot het voortzetten van het onderzoek naar nieuwe antivirale moleculen en doelwitten. Bovendien hebben 9.5 miljoen mensen in ontwikkelingslanden dringend levensreddende antiretrovirale therapie nodig, maar krijgen momenteel maar 4 miljoen mensen antivirale middelen toegediend. Bovendien veroorzaakt de dure, levenslange behandeling van HIV infecties met antivirale middelen ingrijpende neveneffecten. Daarom zijn wetenschappers genoodzaakt om veiligere en goedkopere antivirale middelen te ontwikkelen. Omwille van zijn beperkte genomische capaciteit interageert HIV met vele cellulaire eiwitten om te kunnen vermenigvuldigen. Deze interacties tussen virale en cellulaire eiwitten kunnen mogelijks nieuwe antivirale doelwitten vormen. Het gebruik van de interacties tussen virale en cellulaire factoren als antivirale doelwitten zou een hogere genetische barrière kunnen opwerpen tegen het ontstaan van virale resistentie aangezien het cellulaire deel van de interactie niet variabel is. Bovendien verkleint het gebruik van meerdere stappen van de HIV levenscyclus als doelwit de kans op het ontstaan van multiresistente HIV stammen. De potentiële cellulaire toxiciteit zou een nadeel kunnen zijn van deze benadering. Onze onderzoeksgroep is specifiek geïnteresseerd in de cellulaire cofactoren van het virale enzyme integrase (IN). Lens epithelium-derived growth factor/p75 (LEDGF/p75) is een voorbeeld van een cofactor van IN. In 2003 werd LEDGF/p75 ontdekt als een bindingspartner van IN, en nadien is LEDGF/p75 door verschillende onafhankelijke onderzoeksgroepen gevalideerd als een essentiële cofactor van HIV integratie en als een nieuw doelwit voor antiretrovirale therapie. Wij hebben recent een nieuwe klasse van antivirale moleculen gepubliceerd, de LEDGINS, die de eiwit-eiwit interactie tussen LEDGF/p75 en IN verbreken en een sterke antivirale activiteit vertonen in celcultuur. Deze verwezenlijking versterkt de algemene aanpak om eiwit-eiwit interacties tussen virale en cellulaire factoren te gebruiken als doelwitvoor antivirale therapie. In de algemene inleiding van deze thesis worden de cofactoren van HIV-1 IN besproken, met nadruk op LEDGF/p75 en de ontwikkeling van kleine moleculen als eiwit-eiwit interactie inhibitoren van de interactie tussen LEDGF/p75 en IN. Meer algemeen worden de problemen en uitdagingen beschreven van het onderzoek naar eiwit-eiwit interactie inhibitoren. Wij hebben dit thesisproject opgestart op zoek naar nieuwe cellulaire cofactoren van HIV-1 IN als nieuwe mogelijke antivirale doelwitten. Uit een yeast two-hybrid screen voor cellulaire bindingspartners van HIV-1 IN kwamen verscheidene kandidaten voort, waaronder het cellulaire importine transportine-SR2 (TRN‑SR2). Om een productieve infectie te bewerkstelligen moet het provirale HIV DNA, in een complex met verscheidene virale en cellulaire eiwitten dat het pre-integratiecomplex of PIC genoemd wordt, het nucleaire membraan binnendringen om het chromatine van de gastheercel in de celkern te bereiken, waar IN de stabiele integratie van het provirus in het cellulaire chromatine bewerkstelligt. Deze nucleaire import stap in de levenscyclus van HIV is lang onopgehelderd gebleven omdat er in de literatuur verschillende virale en cellulaire factoren verantwoordelijk werden gesteld voor de nucleaire import van het HIV PIC. Aangezien reeds beschreven werd dat transportine-SR2 SR-rijke eiwitten importeert vanuit het cytoplasma naar de celkern, werd onze interesse gewekt in een mogelijke rol van TRN-SR2 in de nucleaire import van het HIV-1 PIC. In het eerste deel van deze studie hebben we TRN-SR2 gevalideerd als een belangrijke nucleaire import factor van het HIV PIC. Deze resultaten werden gepubliceerd. Reverse yeast two-hybrid screening toonde aan dat geen enkel van de andere HIV eiwitten rechtstreeks interageerde met TRN-SR2. De interactie tussen TRN-SR2 en HIV-1 IN werd aangetoond in pull-down experimenten gebruik makende van recombinante eiwitten en cellulaire lysaten.Zowel in delende als niet-delende cellen, transiënt of stabiel neerwaarts gereguleerd (knockdown) voor TRN-SR2 expressie, werd HIV replicatie sterk geblokkeerd. Er werd aangetoond dat TRN-SR2 knockdown specifiek de vroege maar niet de late stappen van de HIV replicatiecyclus inhibeert. Ten slotte werd een rechtstreeks effect van TRN-SR2 knockdown op de nucleaire import van PICs aangetoond gebruik makende van groen fluorescent proteïne (GFP)-gemerkt HIV. De bovenstaande resultaten werden grotendeels bevestigd in andere studies. Echter, recente publicaties stelden de rol van IN in de TRN-SR2-afhankelijkheid van HIV-1 in vraag en suggereerden dat het HIV-1 capside (CA) eiwit de belangrijkste determinant is van de TRN-SR2-afhankelijkheid van HIV-1. Deze resultaten spraken onze vorige bevindingen, namelijk dat TRN-SR2 interageert met IN, tegen. Daarom hebben we in het tweede deel van deze studie de gepubliceerde data geëvalueerd. We bevestigden de lentivirus-specifieke rol van TRN-SR2 in vector transductie experimenten gebruik makende van verschillende lentivirale en retrovirale vectoren. Er werd aangetoond dat de DNA flap niet betrokken is bij de TRN-SR2-afhankelijkheid van HIV-1. Een chimeer virus dat het muis leukemie virus capside bevat in plaats van het HIV capside, en een HIV-1 N74D CA mutant virus, bleken onafhankelijk te zijn van TRN-SR2 wanneer ze gepseudotypeerd werden met de vesiculair stomatitis virus glycoproteïne enveloppe, hetgeen suggereert dat CA de TRN-SR2-afhankelijkheid van HIV-1 bepaalt. Echter, het HIV-1 N74D CA mutant virus was wel nog gevoelig voor TRN-SR2 knockdown wanneer het de natuurlijke HIV-1 enveloppe droeg. Op deze manier tonen we een tot nog toe onbekend verband aan tussen het binnendringen van de gastheercel en de nucleaire import van het viraal DNA, hetgeen een voorzichtige interpretatie vraagt van andere experimenten die uitgevoerd werden met gepseudotypeerde virussen om de vroege stappen van de virale replicatie te bestuderen. Deze gegevens ondersteunen samen de belangrijke rol van TRN-SR2 in HIV replicatie. Verder onderzoek is nodig om de interactie tussen TRN-SR2 en het HIV PIC op te helderen. Wij beschouwen de interactie tussen TRN-SR2 en IN nu reeds als een interessant nieuw antiviraal doelwit en wij hebben dan ook projecten opgestart om nieuwe moleculen op te sporen die deze interactie kunnen verhinderen.status: publishe

Transient knock-down of the Von Hippel Lindau binding protein 1 (VBP1) in HeLaP4 cells enhances HIV-1 replication

status: publishe

HIV integraseR263A/K264A is defective for TRN-SR2/IN interaction and nuclear import of the PIC

status: publishe

Transportin-SR2 and HIV-1 integrase, partners for HIV nuclear import

status: publishe

Transportin-SR2 and HIV-integrase, partners for HIV nuclear import

status: publishe

A Symmetric Region of the HIV-1 Integrase Dimerization Interface Is Essential for Viral Replication

HIV-1 integrase (IN) is an important target for contemporary antiretroviral drug design research. Historically, efforts at inactivating the enzyme have focused upon blocking its active site. However, it has become apparent that new classes of allosteric inhibitors will be necessary to advance the antiretroviral field in light of the emergence of viral strains resistant to contemporary clinically used IN drugs. In this study we have characterized the importance of a close network of IN residues, distant from the active site, as important for the obligatory multimerization of the enzyme and viral replication as a whole. Specifically, we have determined that the configuration of six residues within a highly symmetrical region at the IN dimerization interface, composed of a four-tiered aromatic interaction flanked by two salt bridges, significantly contributes to proper HIV-1 replication. Additionally, we have utilized a quantitative luminescence assay to examine IN oligomerization and have determined that there is a very low tolerance for amino acid substitutions along this region. Even conservative residue substitutions negatively impacted IN multimerization, resulting in an inactive viral enzyme and a non-replicative virus. We have shown that there is a very low tolerance for amino acid variation at the symmetrical dimeric interface region characterized in this study, and therefore drugs designed to target the amino acid network detailed here could be expected to yield a significantly reduced number of drug-resistant escape mutations compared to contemporary clinically-evaluated antiretrovirals.status: publishe