Antigenspezifität der adaptiven Immunantwort gegen Helminthen

Gastrointestinal helminths are potent inducers of a type 2 immune response and are known for their ability to modulate their host environment. For example, the major human hookworm species, Necator americanus and Ancylostoma duodenale, take up residence in the gastrointestinal tract while benefiting from nutrient supply by feeding on host blood and tissue. The excretory/secretory products, released by helminths as they migrate through their host, play a key role in mediating this host-parasite interface. However, little is known about the helminth-derived antigens and their potential to support a protective immune response. We use the infection model with the mouse-adapted parasite Nippostrongylus brasiliensis (Nb), resembling human hookworm infections, to fill this gap in knowledge. In particular, to identify and characterise novel antigens during Nb infection we performed Western blots with immune serum from Nb-infected mice combined with mass spectrometry analysis of Nb secreted proteins. Our Western blot analysis revealed reactivity of mouse IgG1 as well as IgE against Nb proteins, with a distinct and reoccurring band pattern. We also identified a new Venom/Allergen-like (VAL) protein family with a 17 kDa protein we termed Nb-LSA1a for “Nippostrongylus brasiliensis larval secreted protein 1a”, that is also recognised by immune serum of Nb-infected mice. Upon immunization of mice with recombinantly expressed Nb-LSA1a we detected a strong IgG1 response and, most importantly, a protective effect that was absent in basophil-deficient Mcpt8Cre mice. Our results suggest that Nb-LSA1a immunization elicits a basophil-dependent trapping of Nb larvae in the skin leading to a strong reduction of larval numbers in the lung and eggs in feces. Furthermore, new single cell sequencing technologies combined with IL-4eGFP reporter mice have enabled us to thoroughly investigate open questions regarding Th2 cell subsets and distribution of distinct T cell clones between organs during N. brasiliensis infection. Th2 cells are defined as CD4+ T helper cells that produce the key cytokines IL-4, IL-5 and IL-13 during an immune response against helminths or in the context of allergic inflammation. In recent years, the classical framework of the polarized T helper cell subset model has been challenged by the discovery of several IL-4 producing Th2 subpopulations. Despite new findings about effector functions and plasticity, little is known about clonal distribution of Th2 cells between organs during Nb infection. To address this, we analysed the T cell receptor (TCR) repertoire and gene expression profile of sorted Th2 cells from mesenteric lymph node (MLN) and lung of Nb infected 4get mice. We identified an organ-specific expression profile of Th2 cells, with separation into a lung and MLN population upon dimensional reduction. In detail, we revealed ten clusters with specific gene signatures: two clusters of Th2 cells in lung and seven in MLNs, including an innate-like/NKT cell cluster and subpopulations with an interferon response signature, as well as one cluster with mixed expression profiles of lung and MLN. Our data also supports the idea, that strongly expanded T cell clones are effectively spread over organs and we were able to select TCR clonotypes from clusters of IL-5/IL-13 expressing effector cells for functional analysis in vivo.Gastrointestinale Helminthen sind potente Auslöser einer Typ-2-Immunantwort und bekannt für die Fähigkeit, ihre Wirtsumgebung zu modulieren. Die wichtigsten menschlichen Hakenwurmarten, Necator americanus und Ancylostoma duodenale, siedeln sich beispielsweise im Magen-Darm-Trakt an und profitieren von der Nährstoffversorgung durch die Ernährung mit Blut und Gewebe des Wirts. Die Ausscheidungsprodukte, die von Helminthen auf ihrer Wanderung durch den Wirt freigesetzt werden, spielen eine Schlüsselrolle bei der Vermittlung dieser Schnittstelle zwischen Wirt und Parasit. Über die von Helminthen stammenden Antigene und ihr Potenzial, eine schützende Immunantwort zu unterstützen, ist jedoch wenig bekannt. Um diese Wissenslücke zu schließen verwenden wir das Infektionsmodell mit dem an die Maus angepassten Parasiten Nippostrongylus brasiliensis (Nb), das einer menschlichen Hakenwurminfektion ähnelt. Um neue Antigene während einer Nb-Infektion zu identifizieren und zu charakterisieren, haben wir Western Blots mit Immunseren von Nb-infizierten Mäusen in Kombination mit einer massenspektrometrischen Analyse der von Nb sezernierten Proteine durchgeführt. Unsere Western Blot Analyse ergab eine Reaktivität von Maus-IgG1 sowie IgE gegen Nb-Proteine, mit einem prominenten und wiederkehrenden Bandenmuster. Wir haben auch eine neue Venom/Allergen-ähnliche (VAL) Proteinfamilie mit einem 17 kDa-Protein identifiziert, das wir als Nb-LSA1a für Nippostrongylus brasiliensis larval secreted protein 1a bezeichnet haben und das auch vom Immunserum Nb-infizierter Mäuse erkannt wird. Nach Immunisierung von Mäusen mit rekombinant exprimiertem Nb-LSA1a konnten wir eine starke IgG1-Antwort und vor allem eine schützende Wirkung nachweisen, die bei Mäusen ohne Basophile Zellen (Mcpt8Cre) fehlte. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Nb-LSA1a-Immunisierung ein Basophilen-abhängiges Abfangen von Nb Larven in der Haut auslöst, was zu einer starken Verringerung der Larvenzahlen in der Lunge und der Eier im Kot führt. Darüber hinaus haben uns neue Einzelzell-Sequenzierungstechnologien in Kombination mit IL-4eGFP-Reportermäusen in die Lage versetzt, offene Fragen bezüglich der Th2-Zelluntergruppen und der Verteilung verschiedener T-Zell-Klone zwischen den Organen während einer N. brasiliensis Infektion zu untersuchen. Th2-Zellen sind definiert als CD4+ T Helfer Zellen, die während einer Immunreaktion gegen Helminthen oder im Rahmen einer allergischen Entzündung die Schlüsselzytokine IL-4, IL-5 und IL-13 produzieren. In den letzten Jahren wurde das klassische Modell der polarisierten T-Helferzellen-Subpopulation durch die Entdeckung mehrerer IL-4-produzierender Th2-Subpopulationen in Frage gestellt. Trotz neuer Erkenntnisse über Effektor-Funktionen und Plastizität ist wenig über die klonale Verteilung von Th2-Zellen zwischen Organen während einer Nb Infektion bekannt. Um dies zu untersuchen, haben wir das T-Zell-Rezeptor (TCR)-Repertoire und das Genexpressionsprofil von sortierten Th2-Zellen aus dem mesenterialen Lymphknoten (MLN) und der Lunge von Nb-infizierten 4get-Mäusen analysiert. Wir identifizierten ein organspezifisches Expressionsprofil von Th2-Zellen, das sich bei der dimensionalen Reduktion in eine Lungen- und eine MLN-Population aufteilt. Im Einzelnen ergaben sich zehn Cluster mit spezifischen Gensignaturen:zwei Cluster von Th2-Zellen in der Lunge und sieben in den MLN, darunter ein Cluster mit angeborenen/NKT-Zellen und Subpopulationen mit einer Interferon-Antwort-Signatur, sowie ein Cluster mit gemischten Expressionsprofilen von Lunge und MLN. Unsere Daten unterstützen auch die Idee, dass stark expandierte T-Zell-Klone effektiv über die Organe verteilt sind, und wir waren in der Lage, TCR-Klonotypen aus Clustern von IL-5/IL-13 exprimierenden Effektorzellen für funktionelle Analysen in vivo auszuwählen

A newly identified secreted larval antigen elicits basophil-dependent protective immunity against N. brasiliensis infection

Hookworms infect more that 400 million people and cause significant socio-economic burden on endemic countries. The lack of efficient vaccines and the emergence of anthelminthic drug resistance are of major concern. Free-living hookworm larvae infect their hosts via the skin and live as adult worms in the small intestine where they feed on host tissue and blood. Excretory/secretory (E/S) products, released by helminths as they migrate through their host, are thought to play a key role in facilitating infection and successful establishment of parasitism. However, E/S products can also elicit protective immune responses that might be harnessed for vaccine development. By performing Western blots with serum of Nippostrongylus brasiliensis (Nb) infected mice as a model for human hookworm infection, we identified a largely overlapping set of IgG1- and IgE-reactive antigens in E/S from infective L3 stage larvae. Mass spectrometry analysis led to the identification of a new protein family with 6 paralogues in the Nb genome which we termed Nb-LSA1 for “Nippostrongylus brasiliensis larval secreted protein 1”. The recombinantly expressed 17 kDa family member Nb-LSA1a was recognized by antibodies in the serum of Nb immune mice. Immunization of mice with Nb-LSA1a in alum elicited a strong IgG1 response but no detectable antigen-specific IgE. Most importantly, immunized mice were largely protected against a challenge Nb infection. This effect was dependent on the presence of basophils and occurred before the parasites reached the intestine. Therefore, basophils appear to play a critical role for rapid control of infection with L3 stage larvae in mice immunized with a single secreted larval protein. A better understanding of basophil-mediated protective immunity and identification of potent larval antigens of human hookworms could help to develop promising vaccination strategies