Etude de ligand de l'ADN G-quadruplexe sur la transcription et la prolifération dans des lignées cellulaires humaines

Le@ simple brin télomérique peut adopter une structure en G-quadruplexe. Des composés qui stabilisent ces structures sont capables de bloquer la réplication du télomère et d'induire la sénescence et/ou l'apoptose de lignées tumorales. Plusieurs séquences dans le génome sont potentiellement capables d'adopter une structure en G-quadruplexe. Nous avons mis au point un test PCR permettant d'évaluer la stabilisation du G-quadruplexe du promoteur du gène c-myc par des ligands décrits pour stabiliser le quadruplexe télomérique. A l'aide d'une amorce mutée incapable de former le G-quadruplexe, nous avons déterminé la sélectivité de ces ligands. Le 12459 stabilise la formation de G-quadruplexes de l'intron 6 du gène hTERT dans la lignée A549 et inhibe l'activité télomérase par une altération de l'épissage alternatif de ce gène. Nous avons aussi étudié l'effet de l'insertion d'un quadruplexe dans la séquence codante du gène POT1. Dans ce modèle, les ligands n'inhibent pas la transcription/traduction couplée de la protéine. Par contre, la télomestatine inhibe la traduction et des expériences in vitro suggèrent que la transcription pourrait être inhibée par la présence de ces G-quadruplexes. Enfin, nous avons étudié les effets des ligands dans des cellules ALT régulant leurs tailles de télomère par recombinaison génétique. Ces ligands induisent une cytotoxicité à court terme et un arrêt de la prolifération cellulaire à plus long terme. La télomestatine induit un raccourcissement de la taille du simple brin télomérique à court terme et la réexpression de l'activité télomérase dans une lignée ALT induit une résistance partielle à l'entrée en sénescence par les ligands.REIMS-BU Santé (514542104) / SudocPARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF

Telomerase downregulation induced by the G-quadruplex ligand 12459 in A549 cells is mediated by hTERT RNA alternative splicing

Ligand 12459, a potent G-quadruplex-interacting agent that belongs to the triazine series, was previously shown to downregulate telomerase activity in the human A549 lung carcinoma cell line. We show here that the downregulation of telomerase activity is caused by an alteration of the hTERT splicing pattern induced by 12459, i.e. an almost complete disappearance of the active (+α,+β) transcript and an over-expression of the inactive –β transcript. Spliced intron 6 forming the –β hTERT transcript contained several tracks of G-rich sequences able to form G-quadruplexes. By using a specific PCR-stop assay, we show that 12459 is able to stabilize the formation of these G-quadruplex structures. A549 cell line clones selected for resistance to 12459 have been analyzed for their hTERT splicing pattern. Resistant clones are able to maintain the active hTERT transcript under 12459 treatment, suggesting the appearance of mechanisms able to bypass the 12459-induced splicing alterations. In contrast to 12459, telomestatin and BRACO19, two other G-quadruplex-interacting agents, have no effect on the hTERT splicing pattern in A549 cells, are cytotoxic against the A549-resistant clones and display a lower efficiency to stabilize hTERT G-quadruplexes. These results lead us to propose that 12459 impairs the splicing machinery of hTERT through stabilization of quadruplexes located in the hTERT intron 6. Differences of selectivity between 12459, BRACO19 and telomestatin for these hTERT quadruplexes may be important to explain their respective activity and inactivity against hTERT splicing