Efecto de Tres Crioprotectores en la Criopreservación de Espermatozoides Epididimarios de Alpaca

The study aimed to evaluate the effect of three cryoprotectants: Dimetil Sulfoxide (DMSO), Ethylene glycol (EG) and Glycerol (GL) on the cryopreservation of epididymal alpaca sperm. Testicles of alpacas older than 3 years were used. The epididymides were separated and the tails were dissected. The spermatozoa were recovered with fraction A of the extender (cow skim milk, egg yolk and fructose), selecting samples with sperm motility equal or higher than 50% (n=18, motility = 69%, sperm membrane functional integrity = 48%). The fraction A with the sperm was refrigerated (cooling rate of 1 ºC/5 min) until 5 ºC. The fraction was divided in three and added the same volume of fraction B with the cryoprotectant (DMSO: 7%, 0.9M; EG: 7%, 0.9M; GL: 7%, 1.2M). Then, 0.5 ml straws were filled with the final dilution and frozen in liquid nitrogen. After 7 days of storage, the post-thaw motilities were 31, 8 and 24% and percentages of sperm membrane functional integrity were 28, 17 and 26% for DMSO, EG and GL respectively. An in vitro fertilization trial was conducted with thawed sperm from groups DMSO and GL, where the cleavage rate at 72 h post-fertilization was 47 and 27% respectively and without statistical difference. The results suggest that dimetil sulfoxide and glycerol are more efficient cryoprotective agents in comparison to the ethylene glycol.El estudio tuvo por objetivo evaluar el efecto de tres crioprotectores: Dimetil Sulfóxido (DMSO), Etilenglicol (EG) y Glicerol (GL) sobre la criopreservación de espermatozoides epididimarios de alpaca. Se trabajó con testículos de alpacas mayores de tres años. Se separaron los epidídimos y se diseccionaron las colas. Los espermatozoides fueron recuperados con la fracción A del dilutor (leche descremada, yema de huevo y fructosa) y se emplearon las muestras con motilidad espermática igual o mayor a 50% (n=18, motilidad = 69%, integridad funcional de membrana espermática = 48%). La fracción A con los espermatozoides fue refrigerada (1 ºC/5 min) hasta alcanzar 5 ºC. Esta fracción se dividió en tres y se añadió un volumen igual de la fracción B conteniendo un crioprotector (DMSO: 7%, 0.9M; EG: 7%, 0.9M; GL: 7%, 1.2M). Se llenaron pajillas de 0.5 ml con la dilución final y se congelaron en nitrógeno líquido. Después de 7 días de almacenamiento, las motilidades posdescongelación fueron de 31, 8 y 24% y los porcentajes de integridad funcional de la membrana espermática fueron de 28, 17 y 26% para DMSO, EG y GL, respectivamente. Se llevó a cabo un ensayo de fecundación in vitro con los espermatozoides descongelados de los grupos DMSO y GL, donde la tasa de división a las 72 h posfecundación fue de 47 y 27%, respectivamente, sin diferencias significativas. Los resultados sugieren que el dimetil sulfóxido y el glicerol son agentes crioprotectores más efectivos en comparación al etilenglicol

Efecto de Temperatura y Tiempo de Almacenamiento de Ovarios de Alpacas sobre la Tasa de Maduración y División in vitro de Ovocitos

The present study evaluated the effect of temperature (12-15 and 22-25 °C) and the time of storage (0 and 16 hours) in ovaries of alpacas on the maturation and cleavage rate post in vitro fertilization. The ovaries were collected from slaughtered mature alpacas at Pilpichaca slaughterhouse (Huancavelica, Peru) and transported to the laboratory in 0.9% saline solution with an initial temperature of 35 °C. The ovaries were randomly distributed in three groups: Control (0 h), T1 (16 h at 12-15 °C) and T2 (16 h at 22-25 °C). The oocytes were recovered by slicing of the ovaries and only oocytes with one or more layers of cumulus were selected and cultured in maturation medium TCM-199 for 40 h under 5% CO2 at 39 °C. Part of the oocytes (172) were fixed and dyed to evaluate the stage of nuclear maturation and the rest (440) were co-incubated for 18 h with sperm obtained from epididymis. Later on, the presumed zygotes were placed in KSOM culture medium for 72 h post in vitro fertilization and then transferred to SOF medium. The results showed a nuclear maturation rate in metaphase II of 47.9, 12.2, and 32.7%; a cleavage rate of 46.2, 8.1, and 32.7%; and a blastocyst rate of 33.3, 14.2, and 20.6% for the Control, T1 and T2 groups respectively (p<0.05, except for blastocyst rate in T1 and T2). The results suggested that ovaries of alpaca stored at 22-25 °C for 16 h (T2) would maintain the oocytes quality and allow better maturation and cleavage rate post in vitro fertilization.Se evaluó el efecto de la temperatura (12-15 y 22-25 ºC) y el tiempo de almacenamiento (0 y 16 horas) de ovarios de alpacas sobre la tasa de maduración y división pos-fecundación in vitro. Los ovarios fueron recolectados de alpacas adultas sacrificadas en el camal de Pilpichaca (Huancavelica, Perú) y transportados al laboratorio en solución salina al 0.9% con una temperatura inicial de 35 ºC. Los ovarios fueron distribuidos al azar en los tratamientos Control (0 h), T1 (16 h a 12-15 ºC) y T2 (16 h a 22-25 ºC). Los ovocitos se obtuvieron por disección, seleccionándose aquellos con una o más capas de cúmulos, y madurados en medio TCM 199 por 40 h bajo condiciones de 5% CO2 y 39 °C. Parte de los ovocitos (172) fueron fijados y teñidos para evaluar el estadio de maduración nuclear y los restantes (440) fueron co-cultivados por 18 h con espermatozoides obtenidos de epidídimos. Posteriormente, los presuntos cigotos fueron colocados en medio de cultivo KSOM por 72 h pos-fecundación in vitro y luego transferidos a medio SOF. Se obtuvo una tasa de maduración nuclear en metafase II de 47.9, 12.2 y 32.7%, una tasa de división de 46.2, 8.1 y 32.7% y una tasa de blastocistos de 33.3, 14.2 y 20.6% para los grupos Control, T1 y T2, respectivamente (p<0.05, excepto entre la tasa de blastocistos del T1 y T2). Los resultados sugieren que el almacenamiento de ovarios de alpaca a 22-25 ºC por 16 h (T2) permite mantener la calidad de los ovocitos y obtener una mayor tasa de maduración y de división pos-fecundación in vitro