Expressão diferencial de genes associados à degradação enzimática e destoxificação da torta de pinhão-manso em Pleurotus pulmonarius

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2019.A biodestoxificação da torta de pinhão-manso oferece vantagens sobre outros métodos de destoxificação em termos de eficiência, custo e potencial para desenvolvimento de produtos secundários. No entanto, apesar de todas essas vantagens ainda não foi elucidado o mecanismo envolvido (genes, proteínas e vias metabólicas) nesse processo de biodegradação dos EFs por microorganismo. No cenário de biodestoxificação, o macro-basidiomiceto Pleurotus pulmonarius EF-88 degrada com eficiência esse composto e ainda produzir cogumelos comercialmente viáveis. O presente estudo foi conduzido com a finalidade de identificar genes e mecanismos celulares envolvidos no processo de destoxificação dantorta de pinhão-manso. E para isso, ferramentas transcritômicas (RNA-seq) e proteômicas (LC-MS-MS) foram utilizadas. A degradação dos EFs ao longo do cultivo sólido foi usada como parâmetro para determinar os pontos critícos para análise transcritomica e proteomica. O transcriptoma do P. pulmonarius EF88 foi montado usando a estratégia de novoe foram mapeados um total de 23297 genes. O cultivo do basidiomiceto P. pulmonarius em torta de pinhão-manso tóxica revelou um total de 351 DEGs (genes diferencialmente expressos) dos quais 234 estavam superexpressos e 117 reprimidos. As análises proteômicas quantitativas mostraram que 23 proteínas estavam moduladas em 9DAI e 40 proteínas em 12DAI. De acordo com os resultados obtidos em ambas estratégias foi possível estabelecer um modelo de degradação dos EFs por P. pulmonarius: Proteínas hidrofobinas atuam no recrutamento e de esterases e metaloproteases e estas enzimas hidrolisam as ligações C-13 e C-16 dos EFs, os produtos sencundários formados na hidrolíse inicial são oxidados por monooxigenases P450. Complexos proteicos formados por hidrofobinas e enzimas hidrolíticas (esterase e metaloprotease) podem aumentar a eficiência de degradação dos EFs presentes na torta de pinhão-manso. Os resultados obtidos nesse trabalho fornecem os primeiros resultados a nível molecular envolvidos na biodestoxificação dos EFs por microorganismos, e podem ser usados para solucionar alguns gargalhos relacionados a biodegradação dos ésteres de forbol, como tempo de cultivo e dificuldade de escalomamento.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).The biodetoxification of phorbol esters (PEs) in jatropha cake offers advantages over other approaches for detoxification in terms of efficiency, cost and the potential for development of secondary products. However, despite these advantages, the mechanisms (genes, proteins and metabolic pathways) involved in the biodegradation of PEs by microorganisms has not yet been elucidated. In this context, the macrobasidiomycete Pleurotus pulmonarius EF-88 both enables efficient degradation of PEs and production of commercially viable mushrooms. This study was conducted to identify genes and the cellular mechanisms involved in the detoxification of PEs in jatropha cake. To this end, transcriptional (RNA-seq) and proteomic (LC-MS-MS) approaches were employed. The degradation of PEs throughout solid culture was used as a parameter to determine the critical points for transcriptomic and proteomic analysis. The P. pulmonarius EF88 transcriptome was assembled using a de novo strategy, with a total of 23297 unigenes identified. Cultivation of P. pulmonarius in toxic jatropha cake revealed a total of 351 differentially expressed genes (DEGs), of which 234 were overexpressed and 117 repressed. Quantitative proteomic analyzes showed that 23 proteins were modulated 9 DAI and 40 proteins 12 DAI. According to the results obtained in both strategies, it was possible to establish the following model of degradation of PEs by P. pulmonarius: Hydrophobin proteins act in the recruitment of esterases and metalloproteases and these enzymes hydrolyze the C-13 and C-16 bonds of PEs. The secondary products formed in the initial hydrolysis are oxidized by P450 monooxygenases. Protein complexes formed by hydrophobins and hydrolytic enzymes (esterase and metalloprotease) may increase the degradation efficiency of PEs present in jatropha cake. The results obtained in this work provides the first insights into the mechanisms, at the molecular level, involved in the biodetoxification of PEs by microorganisms and will be applicable to addressing difficulties related to phorbol ester biodegradation such as culture duration and scaling

Development of reference genes for RT-qPCR analysis of gene expression in Pleurotus pulmonarius for biotechnological applications

Abstract Jatropha curcas is an oilseed crop with biorefinery applications. Whilst cake generated following oil extraction offers potential as a protein source for animal feed, inactivation of toxic phorbol esters present in the material is necessary. Pleurotus pulmonarius is a detoxifying agent for jatropha cake with additional potential as animal feed, edible mushroom and for enzyme production. For the characterization of fungal genes involved in phorbol ester degradation, together with other industrial applications, reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR) is a tool that enables accurate quantification of gene expression. For this, reliable analysis requires reference genes for normalization of mRNA levels validated under conditions employed for target genes. The stability of potential reference genes β-TUB, ACTIN, GAPDH, PHOS, EF1α, TRPHO, LAC, MNP3, MYP and VP were evaluated following growth of P. pulmonarius on toxic, non-toxic jatropha cake and a combined treatment, respectively. NormFinder and geNorm algorithms for expression stability analysis identified PHOS, EF1α and MNP3 as appropriate for normalizing gene expression. Reference gene combinations contrasting in ranking were compared following normalization of relative expression of the CHU_2040 gene, encoding an esterase enzyme potentially involved in phorbol ester degradation. The reference genes for P. pulmonarius will facilitate the elucidation of mechanisms involved in detoxification of phorbol esters as well as analysis of target genes for application in biorefinery models

Subprodutos da agroindústria do óleo de palma (dendê) para cultivo de cogumelos comestíveis e nutrição de peixes

Este trabalho teve por objetivos fazer uso dos subprodutos lignocelulósicos da Agroindústria da Palma de Óleo (APO) como substratos para cultivo do cogumelo comestível Pleurotus ostreatus CC389 e utilizar a biomassa pós-colheita ou SMS (inglês: spent mushroom substrate) do P. ostreatus CC389 como um dos ingredientes para formulação de ração para nutrição de alevinos de tambacu. As APOs são estruturadas com uma série de equipamentos e logística que são favoráveis para o cultivo de cogumelos ou pré-tratamento biológico das biomassas vegetais por macrofungos e geração de bioprodutos para aplicação em formulações de ração animal, por exemplo. As autoclaves industriais utilizados nas APOs favorecem a esterilização dos substratos para inoculação do micélio dos macrofungos, assim não necessitando de investimento estrutural para esterilização dos substratos. Aqui também foram utilizados a estratégia de pré-compostagem (7 dias) e esterilização a vapor de uma formulação de substrato para escolha da espécie de Pleurotus. Os resultados quanto ao processo de esterilização dos substratos mostraram a necessidade de buscar embalagens (sacolas) confeccionadas com material plástico que suporte temperaturas acima de 140ºC e 3 Atm, pois as sacolas de polietileno tradicionalmente utilizada para autoclave com 1 Atm de pressão e 121ºC não suportaram e derreteram. As contaminações por fungos “verdes” dos gêneros Trichoderma foram um dos principais problemas, como também o controle da temperatura das salas de cultivo (sem ar-condicionado). Mesmo diante destas adversidades, os resultados da produtividade do Pleurotus ostreatus CC389 foram satisfatórios para a maioria das formulações. As atividades enzimáticas do SMS também foram avaliadas, sendo lacase como predominante. A análise centesimal das formulações e SMS também foram avaliados para compor os ingredientes para nutrição dos alevinos de tambacu. A ração formulada com SMS do cultivo de Pleurotus foi aceita pelos alevinos, que mostraram resultados de digestibilidade semelhantes a ração controle. Deste modo, a agroindústria de palma de óleo apresentam características favoráveis para produção de cogumelos do tipo Pleurotus e insumos para nutrição de peixes (SMS), em função das estruturas físicas, equipamentos e disponibilidade de biomassas lignocelulósicas e proteicas/lipídicas.Palavras-chaves: Biorrefinaria, Agroindústria Palma de óleo, Macrofungos, cogumelos, Nutrição de peixes.

Transcriptome Profiling of the Resistance Response of <i>Musa acuminata</i> subsp. <i>burmannicoides</i>, var. Calcutta 4 to <i>Pseudocercospora musae</i>

Banana (Musa spp.), which is one of the world’s most popular and most traded fruits, is highly susceptible to pests and diseases. Pseudocercospora musae, responsible for Sigatoka leaf spot disease, is a principal fungal pathogen of Musa spp., resulting in serious economic damage to cultivars in the Cavendish subgroup. The aim of this study was to characterize genetic components of the early immune response to P. musae in Musa acuminata subsp. burmannicoides, var. Calcutta 4, a resistant wild diploid. Leaf RNA samples were extracted from Calcutta 4 three days after inoculation with fungal conidiospores, with paired-end sequencing conducted in inoculated and non-inoculated controls using lllumina HiSeq 4000 technology. Following mapping to the reference M. acuminata ssp. malaccensis var. Pahang genome, differentially expressed genes (DEGs) were identified and expression representation analyzed on the basis of gene ontology enrichment, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes orthology and MapMan pathway analysis. Sequence data mapped to 29,757 gene transcript models in the reference Musa genome. A total of 1073 DEGs were identified in pathogen-inoculated cDNA libraries, in comparison to non-inoculated controls, with 32% overexpressed. GO enrichment analysis revealed common assignment to terms that included chitin binding, chitinase activity, pattern binding, oxidoreductase activity and transcription factor (TF) activity. Allocation to KEGG pathways revealed DEGs associated with environmental information processing, signaling, biosynthesis of secondary metabolites, and metabolism of terpenoids and polyketides. With 144 up-regulated DEGs potentially involved in biotic stress response pathways, including genes involved in cell wall reinforcement, PTI responses, TF regulation, phytohormone signaling and secondary metabolism, data demonstrated diverse early-stage defense responses to P. musae. With increased understanding of the defense responses occurring during the incompatible interaction in resistant Calcutta 4, these data are appropriate for the development of effective disease management approaches based on genetic improvement through introgression of candidate genes in superior cultivars

Characterization of microRNAs and Target Genes in <i>Musa acuminata</i> subsp. <i>burmannicoides</i>, var. Calcutta 4 during Interaction with <i>Pseudocercospora musae</i>

Endogenous microRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs that perform post-transcriptional regulatory roles across diverse cellular processes, including defence responses to biotic stresses. Pseudocercospora musae, the causal agent of Sigatoka leaf spot disease in banana (Musa spp.), is an important fungal pathogen of the plant. Illumina HiSeq 2500 sequencing of small RNA libraries derived from leaf material in Musa acuminata subsp. burmannicoides, var. Calcutta 4 (resistant) after inoculation with fungal conidiospores and equivalent non-inoculated controls revealed 202 conserved miRNAs from 30 miR-families together with 24 predicted novel miRNAs. Conserved members included those from families miRNA156, miRNA166, miRNA171, miRNA396, miRNA167, miRNA172, miRNA160, miRNA164, miRNA168, miRNA159, miRNA169, miRNA393, miRNA535, miRNA482, miRNA2118, and miRNA397, all known to be involved in plant immune responses. Gene ontology (GO) analysis of gene targets indicated molecular activity terms related to defence responses that included nucleotide binding, oxidoreductase activity, and protein kinase activity. Biological process terms associated with defence included response to hormone and response to oxidative stress. DNA binding and transcription factor activity also indicated the involvement of miRNA target genes in the regulation of gene expression during defence responses. sRNA-seq expression data for miRNAs and RNAseq data for target genes were validated using stem-loop quantitative real-time PCR (qRT-PCR). For the 11 conserved miRNAs selected based on family abundance and known involvement in plant defence responses, the data revealed a frequent negative correlation of expression between miRNAs and target host genes. This examination provides novel information on miRNA-mediated host defence responses, applicable in genetic engineering for the control of Sigatoka leaf spot disease