Analysis of DNA Recombination Proteins in DNA Damage Response

Chromosomen zijn de dragers van ons erfelijk materiaal. Alle informatie die onze lichaamscellen nodig hebben om te leven, te functioneren als cel en als onderdeel in een bepaald lichaamsdeel en over te dragen op een volgende generatie is hierin opgeslagen. Het is zo belangrijk, dat de cel van elk chromosoom twee kopieën heeft. Chromosomen zijn, onder andere opgebouwd uit DNA, waarin de erfelijke eigenschappen zijn opgeslagen in een specifieke volgorde van bouwstenen.Het DNA staat constant bloot aan beschadiging. Zo vinden er elke dag tussen de 10.000 en 1.000.000 DNA beschadigingen in onze cellen plaats als gevolg van blootstelling aan schadelijke stoffen, maar ook als gevolg van biologische processen in ons lichaam waarbij eveneens schadelijke stoffen ontstaan. DNA schade moet dus elke dag op grote schaal gerepareerd worden en ook nog nauwkeurig: ongerepareerde of onnauwkeurig gerepareerde schade leidt tot veranderingen in ons DNA die we mutaties noemen. Mutaties staan aan de basis van kanker, een van de meest verspreide ziektes in de moderne wereld. Hoe belangrijk DNA herstel is voor ons lichaam blijkt wel uit het onderzoek naar DNA herstel: vele mutaties die DNA herstel mechanismen aantasten zorgen al voor dood in het embryonale stadium en andere, minder ernstige mutaties hebben kanker of andere symptomen tot gevolg. Zonder DNA herstel mechanismen zouden wij waarschijnlijk een minder lang en minder prettig leven hebben. Dit proefschrift beschrijft mijn studie over de reactie van de recombinatie eiwitten, Rad51 en Rad54, op DNA schade in zoogdiercellen. Homologe recombinatie is een DNA herstelmechanisme dat dubbelstrengsbreuken (DSB) en kruisverbindingen in het DNA herstelt. Het zijn zeer schadelijke types DNA schade, waarbij een laesie in een cel al de dood tot gevolg kan hebben voor deze cel. Deze types DNA schade worden onder meer veroorzaakt in de kliniek tijdens röntgen en chemotherapie, want de bedoeling van deze therapieën is om zoveel schade aan het DNA van tumorcellen toe te dienen dat ze sterven, maar de naburige gezonde cellen niet. Zo blijkt dus dat het onderzoek naar DNA herstel niet alleen belangrijk is voor het begrijpen van het ontstaan van kanker, maar ook voor het genezen ervan. Hoofdstuk één geeft een overzicht weer van het belang van DNA herstel, de niveaus van onderzoek, de types DNA schade, de bijbehorende herstelmechanismen en andere functies van homologe recombinatie, een bepaald soort DNA schade herstelmechanisme dat centraal staat in dit proefschrift. Ook wordt daar dieper ingegaan op het herstel van DSBs, waar behalve homologe recombinatie ook een ander, minder precies herstelmechanisme beschikbaar voor is. Homologe recombinatie, een nauwkeurig herstelmechanisme, maakt gebruik van een onbeschadigd, identiek stuk DNA (de homoloog) om het beschadigde stuk te repareren. Hierbij moet, na vaststellen van de schade en het voorbewerken van de beschadigde stukken, eerst het identieke stuk DNA worden opgespoord. Daarna wordt het ontbrekende of beschadigde stuk gekopieerd van de homoloog, waarna beide DNA moleculen weer uit elkaar gaan. De recombinatieherstel eiwitten Rad51 en Rad54 spelen een rol bij het opsporen, kopiëren en uit elkaar gaan van het gebroken DNA molecuul en zijn homoloog. Als men met behulp van een microscoop het gedrag van deze eiwitten volgt, dan kan men zien dat, na het toedienen van DNA schade (DSBs, kruisverbindingen) deze eiwitten in de celkern samenklonteren tot foci. Van deze eigenschap van Rad51 heb ik gebruik gemaakt door DNA schade gevoelige mutanten te testen op hun mogelijkheid om toegediende schade te herstellen door middel van homologe recombinatie. Het voordeel is dat men niet alleen het effect van bekende mutaties op recombinatieherstel kan bekijken, maar ook dat van onbekende. Op die manier is ook gebleken dat de mutatie in de stralingsgevoelige hamstermutant VC-8 het borstkankergen2 (BRCA2) aantast. Dit staat allemaal beschreven in hoofdstuk twee. Ook in hoofdstuk drie is gebruik gemaakt van de focusformatie van Rad51, in dit geval om het functioneren van het andere recombinatie-eiwit, Rad54, onder de loep te nemen. Het laatste vormt ook foci in antwoord op DNA schade en de focusformatie van beide eiwitten blijkt inderdaad specifiek te zijn voor de typen DNA schade waarvoor recombinatieherstel nodig is. Ook is Rad54 vrij belangrijk voor Rad51 focusformatie: de Rad54KO mutant cellen hebben duidelijk moeite met het vormen van stabiele Rad51 foci in reactie op ioniserende straling. Het Rad54 eiwit blijkt het makelijker te maken voor dubbelstrengs DNA, waarbij beide strengen om elkaar heen zijn gewonden, om lokaal te ontwinden, waardoor er een opening in het dubbelstrengs DNA ontstaat. Dit zou een stabiliserende ofwel stimulerende rol kunnen hebben bij het vormen van de zogenaamde joint molecule (JM), een structuur waarbij het gebroken DNA molecuul het intacte, homologe DNA binnenkomt om een kopie te maken voor het herstel. In hoofdstuk vier worden deze bevindingen, samen met recente resultaten over Rad54 van andere onderzoeksgroepen besproken en in perspectief geplaatst. In hoofdstuk vijf wordt weer gebruik gemaakt van de focusformatie van recombinatie-eiwitten als gevolg van DNA schade. In dit geval is gebruik gemaakt van Rad54 als indicatoreiwit. Echter, in tegenstelling tot de vorige hoofdstukken wordt er geen directe DNA schade in de cellen geïnduceerd. Dit keer wordt een DNA replicatieremmer, genaamd hydroxy-ureum (HU), gebruikt. Zoals uitgelegd in hoofdstuk een (sectie 1.5) spelen recombinatie-eiwitten namelijk ook een rol in de bacteriële DNA replicatie. In zoogdiercellen wordt een soortgelijke rol vermoed, maar harde bewijzen zijn er vooralsnog niet. HU stopt de DNA replicatieprocessen en toediening van dit stofje zet cellen aan tot Rad54 focusformatie. Focusformatie kan geïnduceerd zijn omdat het ontstaan van DSBs een neveneffect is van HU behandeling. DSBs ontstaan vlakbij de plaats waar de DNA replicatie gestopt is. De Rad54KO mutant cellen bevatten inderdaad significant meer DSBs na HU behandeling dan normale cellen. Echter, onder de experimentele condities is DSB herstel moeilijk uit te voeren en dan is recombinatieherstel capabele cel niet in het voordeel op een hersteldeficiënte cel. Dus de opeenhoping van DSBs in de mutant hoeft geen gevolg te zijn van het defect in DSB herstel. Bovendien blijken in HU behandelde cellen de geïnduceerde Rad54 foci veel sneller te verdwijnen dan in bestraalde cellen, zodra de cellen de kans krijgen om de schade te herstellen. Waarschijnlijk zijn de HU geïnduceerde foci gerelateerd aan de stopgezette replicatie, terwijl de stralingsgeïnduceerde foci gerelateerd zijn aan het herstel van de ontstane DSBs. Een replicatiegerelateerde functie van Rad54 zou kunnen liggen in het beschermen of verwerken van de stopgezette replicatie waardoor er minder DSBs ontstaan.Chromosomes are the carriers of our genome. All the information for a cell's survival and propagation is stored there in the base sequence of the DNA. Unfortunately, our DNA is under continuous attack from DNA damaging agents, of which some are produced during a cell's own metabolic processes, while others may be of exogenous origin. DNA damage leads to mutations if not (or incorrectly) repaired and, depending on the nature of the mutation, can lead to cancer or other diseases. Our cells suffers 10,000-1,000,000 DNA lesions a day, but still many of us do not develop cancer or, if so, at a relatively late age. This illustrates the importance of the various DNA repair mechanisms in our body: without it we would not be able to survive for long. The research described in this thesis is about the response of proteins involved in homologous recombination, one of the DNA repair pathways, to DNA damage in mammalian cells. Recombinational repair is involved in the repair of a special class of DNA lesions: double strand breaks (DSBs) and interstrand cross-links (ICLs). These are a very toxic class of lesions, i.e. even one DSB could be lethal to a cell (if left unrepaired). DSBs can also be repaired by another pathway, called non-homologous end-joining. The critical differences between end-joining and recombination is that during end-joining the broken ends of a DNA molecule are stuck together, which is not necessarily error-free. Homologous recombination on the other hand, uses an undamaged, identical piece of DNA as a template, makes a copy of it in order to repair the damaged molecule and is error-free. However, this is not an easy task, as the template, usually the sister chromatid or homologous chromosome, must be found. Then the broken molecule must pair and one (or both) of the recessed ends must invade the template molecule. These steps, named homologous pairing and strand exchange/invasion are considered to be the critical steps of homologous recombination. Key proteins involved in these processes are the in chapter one described Rad52 group of proteins, which includes Rad51 and Rad54, the central proteins of this thesis. Equally, the nature and importance of DNA lesions, the various DNA repair pathways and the two other functions of recombination are described in this introductory chapter. To study the proper functioning of Rad51 after DNA damage, we made use of one particular feature of the protein which is described in chapter two: it redistributes into nuclear foci as a response to treatment with DNA damaging agents that cause DSBs and ICLs. Since Rad52 and the Rad51 paralogues XRCC2 and XRCC3 are also involved in recombinational repair we screened the respective mutant cell lines to assess the hierarchy and order of these proteins relative to Rad51. As the XRCC2 and XRCC3 mutants were unable to form Rad51 foci in response to induced DNA damage, we concluded that the XRCC2 and XRCC3 proteins are essential for proper Rad51 functioning after DSB and ICL induction. A Rad52KO mutation did not lead to ablation of Rad51 foci, but using a cell line expressing a Rad52GFP construct we could demonstrate that both Rad51 and Rad52 form damage inducible foci and partially co-localize. Thus, though Rad52 is involved, it is not essential for Rad51-associated DSB repair in mammalian cells. We also screened other mutant cell lines, known for their sensitivity for DSB or ICL inducing agents to detect whether the gene products they were mutated in were essential for Rad51-associated repair. The Snm1 mutant and V-H4 cell line were able to form Rad51 foci, but the VC-8 cell line was unable to form foci. Complementation studies revealed that the mutation involved the breast cancer associated gene Brca2. We also looked for interactions between Rad51 and Rad54, as described in chapter three. We found that Rad54 also forms foci as a response to DSB inducing ionizing radiation (IR). In addition, we tested different types of DNA damaging agents to see which ones could induce Rad51 and Rad54 foci. Not only do these damage-inducible foci co-localize, but the proteins do physically interact, which we could only detect after inducing DSBs. We provided evidence that DNA damage-induced Rad51 foci are less stable in the absence of Rad54. From results of a topological assay we conclude that Rad54 is capable of introducing supercoiling in dsDNA by translocating along it, which could be important for the formation or stabilization of Rad51-mediated joint molecule formation. The mechanistic and biochemical functions of Rad54 are further discussed in chapter four. In this chapter, our own results and recent biochemical data of others are put in perspective and argue that Rad54 is a much more versatile protein than previously thought. Originally considered as an accessory protein whose mechanistic functions had not been properly clarified we discuss that it could have important functions throughout the three main stages of recombination; during pre-synapsis, when it stabilizes Rad51 nucleoprotein filaments, during joint formation or synapsis, and post-synapsis when it could remove the recombination proteins after the reaction. DSBs can be formed by treating cells with DNA damaging agents. However, DSBs also occur during DNA replication, another process in which homologous recombination is involved (see chapter one, section 1.5). The DSBs could occur in the vicinity of stalled replication forks and we investigated this in closer detail in chapter five. Using hydroxy-urea (HU), a replication inhibitor, and looking for Rad54 foci formation as an indicator for DNA damage, we found that Rad54 foci are formed indeed when replication is stalled. Formation of these foci was biologically relevant, as we observed that Rad54KO icells are sensitive to HU. However, the number of foci positive cells disappears much faster in HU-treated cell populations than in IR-treated populations, indicating that the HU-induced foci probably reflect a process different from the usual DSB repair. Although we found accumulation of HU-induced DSBs in the absence of Rad54, we think that it is not due to a defect in HR-mediated DSB repai,r because this process is likely to be very inefficient in the presence of HU, even in DSB-proficient cells. Possibly, a function of Rad54 is to regr

Cyanoacrylate Dermal Closure in Spine Surgery: Systematic Review and Pooled Analysis

Study Design: Systematic review. Objectives: Cyanoacrylate glue closure has been utilized for dermal closure in surgical incisions. Its safety and efficacy in spine surgery are not established. The authors perform a systematic review to determine the rate of surgical site infection (SSI), wound dehiscence, and wound erythema with cyanoacrylate dermal closure in spine surgery. Methods: A systematic review adhering to PRISMA (Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses) guidelines was performed utilizing the PubMed/MEDLINE, EMBASE, and Cochrane databases on patients undergoing spine surgery with cyanoacrylate dermal closure. Pooled analysis was performed with stratification of patients according to spinal level and the presence/absence of instrumentation. Risk-of-bias and methodological quality was appraised using 17 prespecified criteria. Results: Five articles (1 retrospective cohort study, 4 cases series) with a total of 1282 patients were included. A total of 967 patients, all diagnosed with degenerative spine disease, were suitable for pooled analysis. In 290 patients who underwent anterior cervical discectomy and fusion, and in 23 patients with posterior cervical decompression (without instrumentation), there was 0% rate of SSI, wound dehiscence, and erythema. In 489 patients who underwent lumbar microdiscectomy, there was 0.41% rate of SSI, 0.20% rate of wound dehiscence, and 0.20% rate of wound erythema. In 165 lumbar laminectomy patients, there was a 1.82% rate of SSI, 0.61% rate of wound dehiscence, and 0% rate of wound erythema. Conclusion: Cyanoacrylate dermal closure for the aforementioned procedures is associated with low rates of wound complications (SSI, dehiscence, and erythema). Further studies should be performed, especially in nondegenerative surgery, instrumented thoracic and lumbar spine surgery

The Safety Profile of Intentional or Iatrogenic Sacrifice of the Artery of Adamkiewciz and Its Vicinity's Spinal Segmental Arteries: A Systematic Review

Study Design: Systematic review. Objectives: There is paucity of consensus on whether (1) the artery of Adamkiewicz (AoA) and (2) the number of contiguous segmental spinal arteries (SSAs) that can be safely ligated without causing spinal cord ischemia. The objective of this review is to determine the risk of motor neurological deficits from iatrogenic sacrifice of the (1) AoA and (2) its vicinity’s SSAs. Methods: Systematic review of the spine and vascular surgery was carried out in accordance to PRISMA guidelines. Outcomes in terms of risk of postoperative motor neurological deficit with occlusion of the AoA, bilateral contiguous SSAs, or unilateral contiguous SSAs were analyzed. Results: Ten articles, all retrospective case series, were included. Three studies (total N ¼ 50) demonstrated a postoperative neurological deficit risk of 4.0% when the AoA is occluded. When 1 to 6 pairs of SSAs (without knowledge of AoA location) were ligated, the postoperative neurological deficit risk was 0.6%, as compared with 5.4% when more than 6 bilateral pairs of SSAs were ligated (relative risk [RR] ¼ 0.105, 95% CI 0.013-0.841, P ¼ .0337). For unilateral ligation of SSAs of two to nine levels, the risk of postoperative neurological deficit does not exceed 1.3%. Conclusion: The current best evidence indicates that (1) occlusion of the AoA and (2) occlusion of up to 6 pairs of SSAs is associated with a low risk of postoperative neurological deficit. This limited number of low quality studies restrict the ability to draw definitive conclusions. Ligation of AoA and SSAs should only be undertaken when absolutely required to mitigate the small but devastating risk of paralysis

Effect of sexual steroids on the calcium content of aortic atherosclerotic plaque of oophorectomized rabbits

We determined the effect of conjugated equine estrogen plus medroxyprogesterone acetate on calcium content of aortic atherosclerotic lesions in oophorectomized adult New Zealand rabbits submitted to a cholesterol rich diet. Five groups of 10 animals each were studied: G1 = control, G2 = cholesterol diet only, G3 = diet plus conjugated equine estrogen (0.625 mg/day); G4 and G5 = diet, conjugated equine estrogen (0.625 mg/day) plus medroxyprogesterone acetate (5 and 10 mg/day, respectively). Mean weight varied from 2.7 ± 0.27 to 3.1 ± 0.20 kg (P = 0.38) between groups at the beginning and 3.1 ± 0.27 to 3.5 ± 0.20 kg (P = 0.35) at the end of the experiment. Cholesterol and triglyceride levels were determined at the time of oophorectomy, 21 days after surgery (time 0), and at the end of follow-up of 90 days. The planimetric method was used to measure plaque and caryometric method for histopathologic examination of the aorta. Calcium content was determined by the method of von Kossa. A similar increase in cholesterol occurred in all treated groups without differences between them at the end of the study. Groups G4 and G5 had smaller areas of atherosclerotic lesions (2.33 ± 2.8 and 2.45 ± 2.1 cm², respectively) than the groups receiving no progestogens (G2: 5.6 ± 4 and G3: 4.6 ± 2.8 cm²; P = 0.02). The relation between lesion area and total aorta area was smaller in groups treated with combined drugs compared to the groups receiving no progesterone (G4: 14.9 ± 13 and G5: 14.2 ± 13.4 vs G2: 35.8 ± 26 and G3: 25 ± 8 cm², respectively; P = 0.017). Oral conjugated equine estrogen (0.625 mg/day) plus medroxyprogesterone acetate (5 or 10 mg/day) provoked a greater reduction in atherosclerotic plaque area and calcium content in treated groups, suggesting a dose-dependent effect