A Pol V–Mediated Silencing, Independent of RNA–Directed DNA Methylation, Applies to 5S rDNA

The plant-specific RNA polymerases Pol IV and Pol V are essential to RNA–directed DNA methylation (RdDM), which also requires activities from RDR2 (RNA–Dependent RNA Polymerase 2), DCL3 (Dicer-Like 3), AGO4 (Argonaute), and DRM2 (Domains Rearranged Methyltransferase 2). RdDM is dedicated to the methylation of target sequences which include transposable elements, regulatory regions of several protein-coding genes, and 5S rRNA–encoding DNA (rDNA) arrays. In this paper, we have studied the expression of the 5S-210 transcript, a marker of silencing release at 5S RNA genes, to show a differential impact of RNA polymerases IV and V on 5S rDNA arrays during early development of the plant. Using a combination of molecular and cytological assays, we show that Pol IV, RDR2, DRM2, and Pol V, actors of the RdDM, are required to maintain a transcriptional silencing of 5S RNA genes at chromosomes 4 and 5. Moreover, we have shown a derepression associated to chromatin decondensation specific to the 5S array from chromosome 4 and restricted to the Pol V–loss of function. In conclusion, our results highlight a new role for Pol V on 5S rDNA, which is RdDM–independent and comes specifically at chromosome 4, in addition to the RdDM pathway

Evolution des mitochondries pendant l'ovogenese de drosophile : morphologie, distribution, replication et expression du genome

SIGLECNRS T Bordereau / INIST-CNRS - Institut de l'Information Scientifique et TechniqueFRFranc

Régulation de l'expression du facteur de transcription TFIIIA et des gènes d'ARN ribosomiques 5S chez Arabidopsis thaliana

Chez Arabidopsis thaliana, les gènes d ARNr 5S sont transcrits par l ARN polymérase III qui fait intervenir plusieurs facteurs de transcription dont TFIIIA qui reconnaît spécifiquement le promoteur interne de ces gènes et permet ainsi le recrutement de l ensemble du complexe de transcription. Le gène TFIIIA est composé de sept exons dont le troisième, résultant de l exonisation d une molécule d ARNr 5S, est épissé de façon alternative produisant ainsi deux transcrits. Le transcrit ES, qui ne contient pas cet exon, code pour la protéine TFIIIA pleine longueur et fonctionnelle. Le transcrit EI, dans lequel l exon 5S-like est maintenu, est reconnu et dégradé par la voie NMD (Non-Mediated Decay). L exon 5S-like a, en effet, la particularité de contenir un codon stop prémature qui en fait une cible de la voie NMD. Lors de l étude de l expression des transcrits ES et EI ainsi que celle de l accumulation de la protéine TFIIIA au cours du développement, nous avons montré que le taux de la protéine TFIIIA fonctionnelle est soumis à plusieurs niveaux de régulation. En effet, la production de la protéine TFIIIA pleine longueur est le résultat de la synthèse du transcrit ES et de sa traduction mais également de l efficacité du clivage protéolytique de la protéine. Lors dela maturation de la graine, l accumulation croissante de protéine TFIIIA résulte d une augmentation des quantités de transcrits ES couplée à une diminution du clivage protéolytique. Dans les premiers jours du développement, la protéine TFIIIA n est détectée qu après le 4ème jour, suite à la diminution du clivage. Sa présence est corrélée au remodelage de la chromatine de l ADNr 5S. La combinaison de ces deux mécanismes permet ainsi la production de TFIIIA et de son produit de transcription l ARNr 5S en fonction des besoins de la plante.In Arabidopsis thaliana, 5S rRNA genes are transcribed by RNA polymerase III. TFIIIA, specifically required for transcription of these genes, binds to the internal control region of the 5S rRNA genes and allows the assembly of the full transcription complex pol III. The TFIIIA gene consists of seven exons, the third of which results in the exonisation of one 5S rRNA molecule. This exon 5S-like is alternatively skipped or included to produce either of two transcript isoforms. The ES transcript encodes the fully functional TFIIIA protein. The EI transcript, which contains the exon 5S-like , is a target of the NMD pathway (Non-Mediated Decay). Indeed, the exon 5S-like contains a premature stop codon, which is recognized by this RNA decay pathway. During the study of the ES and EI transcripts expression and the TFIIIA protein accumulation throughout the plant development, we show that TFIIIA functional protein levels are under control of many regulation steps. Actually the production of the full-length TFIIIA protein results from production and translation of the ES transcript but also from the proteolytic cleavage efficiency of TFIIIA protein. During the seed maturation, the strong accumulation of TFIIIA results from an increase in ES amounts and a proteolytic cleavage decrease. After the fourth day post-germination, TFIIIA protein is detected because the proteolytic cleavage decreases. TFIIIA presence is correlated with 5S rDNA chromatin reorganization. The combination of these two mechanisms allows TFIIIA production and its transcription product 5S rRNA according to the plants needs.CLERMONT FD-Bib.électronique (631139902) / SudocSudocFranceF

Etude des régulations génétiques et épigénétiques de l'expression des gènes d'ARNr 5S chez Arabidopsis thaliana

Chez Arabidopsis thaliana, les gènes d'ARNr5S, transcrits par l'ARN polymérase III, sont présents à environs 1000 copies regroupées en blocs situés au niveau de l'hétérochromatine péricentromérique des chromosomes 3,4 et 5. Le chromosome 5 porte un locus d'ADNr 5S sur chacun de ses bras. Seuls les loci du chromosome 4 et du bras gauche du chromosome 5 contiennent des gènes d'arn 5S transcrits. La population d'ARNr 5S est hétérogène chez Arabidopsis et se caractérise par la présence d'un ARNr 5S dit "majoritaire", représentant plus de 90% des transcrits 5S de la cellule, et d'ARN 5S "minoritaires" différant du transcrit 5S majoritaire par une ou deux substitutions nucléotidiques. Dans le cadre de l'étude de la régulation génétique de l'expression des gènes d'ARN 5S, nous avons identifié cloné et caractérisé TFIIIA d'Arabidopsis, qui est le facteur de transcription spécifique des gènes d'ARNr 5S. Lors de cette étude, nous avons également identifié un produit d'épissage alternatif du gène TFIIIA, codant une protéine plus courte que TFIIIA dans sa partie N-terminale dénomée TFIIIAbis. L'analyse de lignées RNAi ciblant TFIIIAbis et des expériences de transcription in vitro, ont suggéré que l'TFIIIAbis aurait un effet positif sur le taux global des ARNr 5S, probablement en stabilisant ces ARN. Nous avons aussi mené une étude de la régulation épigénétique de l'expression des gènes d'ARNr 5S. Ainsi, nous avons démontré l'implication de la méthylation de l'ADN dans la répression de la transcription des gènes d'ARNr 5S minoritaires. L'expression de ces gènes est aussi contrôlée par la voie de répression transcriptionnelle indépendante de la méthylation ADN dont MOM1 fait partie. Nous avons identifié un nouveau type de transcrits provenant de gènes d'ARNr 5S, appelés ARNr 5S-210. De la même façon que les ARNr 5S minoritaires, l'expression des ARNr 5S-210 est contrôlée par la méthylation de l'ADN et par la voie de répression contenant MOM1. Enfin, nous montrons que toutes les séquences répétées hétérochromatiques, à l'exception des éléments transposables, sont soumises à ces deux voies de répressionCLERMONT FD-BCIU Sci.et Tech. (630142101) / SudocSudocFranceF

Implication de mécanismes épigénétiques dans la régulation de la transcription des gènes d'ARNr 5S chez Arabidopdsis thaliana

CLERMONT FD-BCIU Sci.et Tech. (630142101) / SudocSudocFranceF

Cartographie et caractérisation des gènes d'ADNr 5S chez Arabidopsis thaliana: Identification des ARNr 5S matures

CLERMONT FD-BCIU Sci.et Tech. (630142101) / SudocSudocFranceF

Methylation of a euchromatin-heterochromatin transition region in Arabidopsis thaliana chromosome 5 left arm.

International audienceCytosine methylation was studied at the level of the euchromatin/heterochromatin transition genomic region of the Arabidopsis chromosome 5 left arm. It has been shown using a monoclonal antibody against 5-methylcytosines that the density of DNA methylation increases from the euchromatin towards the heterochromatin. YACs mapped along this region were characterized for their repeated sequences content. Some of them, corresponding to euchromatin, euchromatin/heterochromatin border and heterochromatin regions, were used as probes for a Southern blot analysis of methylation. This revealed that the degree of mCmCGG and GATmC methylation increases significantly from the euchromatin towards the heterochromatin. Moreover, an analysis of cytosine methylation levels (% of 5-methylcytosine) of different DNA fragments, inside the same genomic region, was performed using PCR and/or Southern blot approaches. There is a gradual increase of methylation along the genomic region analyzed: CpG methylation in the euchromatic fraction, CpG and CpNpG methylation at the euchromatin/heterochromatin transition and an additional asymmetrical methylation in the repeated-heterochromatic fraction. The most methylated repeated family at CpG, CpNpG and asymmetrical sites is the 5S ribosomal DNA, highly methylated even though it is transcribed

MOM1 mediates DNA-methylation-independent silencing of repetitive sequences in Arabidopsis

The heterochromatic regions around centromeres of animal and plant chromosomes are composed of tandem repetitive sequences, interspersed with transposons and transposon derivatives. These sequences are largely transcriptionally silent and highly methylated, and are associated with specifically modified histones. Although embedded in heterochromatin, Arabidopsis 5S ribosomal RNA genes are among the most highly transcribed genes. However, some 5S genes are silenced, and we show here that this silencing can be suppressed by a reduction in CG methylation. Importantly, we show that mutation of MORPHEUS' MOLECULE 1 (MOM1) releases 5S repeat silencing independently of chromatin properties, as illustrated by the absence of detectable alteration of DNA and histone H3 methylation patterns. MOM1 also prevents transcription of 180-bp satellite repeats and 106B dispersed repeats but not of transposons. Our results provide evidence that transcription of densely methylated and highly repetitive heterochromatic sequences is controlled by two distinct epigenetic silencing pathways, one dependent on and the other independent of DNA methylation

MOM1 mediates DNA-methylation-independent silencing of repetitive sequences in Arabidopsis

The heterochromatic regions around centromeres of animal and plant chromosomes are composed of tandem repetitive sequences, interspersed with transposons and transposon derivatives. These sequences are largely transcriptionally silent and highly methylated, and are associated with specifically modified histones. Although embedded in heterochromatin, Arabidopsis 5S ribosomal RNA genes are among the most highly transcribed genes. However, some 5S genes are silenced, and we show here that this silencing can be suppressed by a reduction in CG methylation. Importantly, we show that mutation of MORPHEUS' MOLECULE 1 (MOM1) releases 5S repeat silencing independently of chromatin properties, as illustrated by the absence of detectable alteration of DNA and histone H3 methylation patterns. MOM1 also prevents transcription of 180-bp satellite repeats and 106B dispersed repeats but not of transposons. Our results provide evidence that transcription of densely methylated and highly repetitive heterochromatic sequences is controlled by two distinct epigenetic silencing pathways, one dependent on and the other independent of DNA methylation