Testing the efficiency of extraction of incurred residues from soil with optimized multi-residue method

K

Distribution of pesticide residues in soil and uncertainty of sampling

K

A glifozát maradékainak jelenléte környezetünkben, és analitikai meghatározásának lehetőségei = The presence of glyphosate residues in our environment and possibilities for their analytical determination

Amikor a mezőgazdasági termelők 1974-ben megismerkedtek az akkor vadonatúj és nagy előnyöket ígérő gyomirtó szerrel, a glifozáttal, vajon ki gondolta volna, hogy közel 40 év múltán a molekuláris biológiai nagyipar olyan növényeket fog előállítani, amelyek az addigra elavulni látszó hatóanyag diadalútját fogják beláthatatlan időre meghosszabbítani? A glifozát - N-(foszfonometil)-glicint -, mint leendő herbicid hatóanyagot 1971-ben az amerikai Monsanto cég szabadalmaztatta. A belőle előállított készítmény a „Roundup” fantázianevet kapta. A szer a növények levelébe szívódva blokkolja az 5-enolpiruvátsikiminsav-3-foszfát szintáz enzim (EPSPS) működését, így megakadályozza az aromás gyűrűt tartalmazó aminosavak (fenilalanin, tirozin, triptofán) szintézisét. így a permet felszívódását követő, néhány napon belül a növény elpusztul. A glifozát házi kertekben is alkalmazható az agresszíven tért hódító tarackbúza ellen, azonban - saját tapasztalatunk szerint - kissé túladagolva, a szer totális gyomirtóként tönkreteheti a kert kultúrnövényeit is. Az 1980-as évek végén új fejezet kezdődött a molekuláris biológiai kutatások eredményeinek agrotechnikai vonatkozású alkalmazásában. Megjelentek az első szabadföldön termesztett genetikailag módosított növények. Közöttük az egyik, talán legnagyobb jelentőségű „termék” a glifozáttal szemben ellenálló növény, a Roundup Ready Soybean (RR szója) volt. Az RR szója szabadalmának tulajdonosa szintén a Monsanto. A glifozát felhasználásának növekvő üteme, és az a tény, hogy egy európai felmérés során 182 ember vizeletében 44% gyakorisággal sikerült a hatóanyag jelenlétét kimutatni, arra ösztönzött bennünket, hogy a WESSLING Hungary Kft. laboratóriumaiban módszert állítsunk be a glifozát maradékainak kimutatására növényi és állati eredetű élelmiszerekből, mezőgazdasági terményekből. A mérésekhez LC-MS-MS technikát alkalmaztunk electrospray ionforrással és negatív ionizációval. A vegyület azonosítását az LC-MS-MS rendszerben a 168—>63, 168—>79 és 168—>150 átmenetek figyelésével végeztük. Kidolgozott módszerünket almából és tehéntejből készült mintakivonatok elemzésével validáltuk. Ezen túlmenően a laboratóriumba érkező egyéb mátrixok elemzésénél kapott analitikai teljesítményjellemzők felhasználásával folyamatos validálást („on-going” validation) is végeztünk. Kidolgozott módszerünkkel 10 és 100 pg/kg szinten R=79,4%-os átlagos visszanyerést és RSD=12,6%-os relatív szórás-adatot értünk el. így módszerünk ismételhetőségét, valamint torzítatlanságát megfelelőnek ítéltük. Bízunk benne, hogy e herbicid-molekula maradékainak laboratóriumi vizsgálatával hozzájárulhatunk hazánk élelmiszer- és környezetbiztonságának javításához. When, in 1974, agricultural producers first learned about the then brand new herbicide glyphosate, promising great benefits, who would have thought that in close to forty years the molecular biology industry would be producing plants that will prolong for the unforeseeable future the triumphant march of an active ingredient that seemed to become obsolete? Glyphosate – N-(phosphonomethyl)glycine – was patented by the American company Monsanto as a future herbicide in 1971. The product containing the compound was given the trade name „Roundup”. It acts by entering plant leaves and inhibiting the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS), preventing the the synthesis of amino acids containing aromatic rings (phenylalanine, tyrosine, tryptophan). Thus, within a few days after the absorption of the spray, the plant dies. Glyphosate can also be applied in vegetable gardens against agressively spreading couch grass, however, in our own experience, if slightly overdosed, as a total herbicide, it can wipe out the cultivated plants of the garden as well. In the late 1980s, a new chapter has begun in the agrotechnical application of the results of research in molecular biology. The first genetically modified plants produced outdoors appeared. Among these was Roundup Ready Soybean (RR soybean) resistant to glyphosate, probably the „product” of greatest significance. The patent for RR soybean is also owned by Monsanto. The increasing rate of use of glyphosate and the fact that, according to a European survey, the presence of the compound was detected in the urine of 182 people at a frequency of 44%, encouraged us to set up a method in the laboratories of WESSLING Hungary Kft. for the determination of glyphosate residues in foods of vegetable and animal origin, and agricultural products. LC-MS-MS technique was used for the measurements with an electrospray ion source and negative ionization. Identification of the compound in the LC-MS-MS system was performed by monitoring the 168→63, 168→79 and 168→150 transitions. The method developed was validated by the analysis of sample extracts obtained from apples and cow’s milk. In addition, an on-going validation has also been performed using the analytical performance characteristics obtained while analyzing other matrices received by the laboratory. With our method, an average recovery of R=79.4% and a relative standard deviation of RSD=12.6% was achieved at the 10 and 100 μg/kg levels. Thus, repeatability and accuracy of our method were deemed satisfactory. We hope that we can contribute to the imporvement of food and environmental safety of Hungary with the laboratory analysis of the residues of this herbicide molecule

Az élelmiszerek növényvédőszermaradék tartalma ellenőrzésének elvi alapjai és gyakorlati megvalósítása = Principles and practices of control of pesticide residues in food

A közlemény összefoglalja a növényvédőszer-maradék eloszlásával kapcsolatos ismereteket az egyedi terményekben illetve a szabványokban rögzített mintavételi eljárással vett összetett mintákban. Az elemzéshez rendelkezésre álló több mint 19000 egyedi terményben, 144 üzemi kezelést követő mintában, 1900 növényvédő szer növény kombinációban végzett szerkísérletekből származó egyedi mintákban, valamint a kísérleti területekről vett >1200 duplikált mintapárban mért szermaradék értékeket nagyszámú számítógépes modellkísérlettel kiegészítve 19 termékcsoportra meghatároztuk a mintavétel tipikus hibáját. A potenciálisan több termőterületről származó árúk ellenőrzésénél a tipikus mintavételi bizonytalanságnál 1.4 szer magasabb értékkel célszerű számolni. A forgalmazás előtti termék-megfelelőség ellenőrzésénél a mérési eredmény értékelésekor mintavétel és a laboratóriumi mérés reprodukálhatóságát magában foglaló kombinált bizonytalanságot kell figyelembe venni. A növényi termények növényvédőszer-maradék tartalmának forgalmazás előtti ellenőrzésénél javasoljuk az engedélyezett növényvédőszer-maradék határértéknél alacsonyabb cselekvési színt megállapítását. Gyakorlati példákkal illusztráljuk a számítását megkönnyítő Excel makró alkalmazását és a kapott eredményeket. This paper reviews the information available on the characteristics of the distribution of pesticide residues in primary and composite samples of sizes specified by relevant standards. Residue data measured in >19000 crop units, 144 composite samples taken from commercially treated crops, supervised trials samples taken from 1900 crop-pesticide combinations, >1200 duplicate samples taken from supervised trials were evaluated and complemented with numerous computer modelling for the determination of typical sampling uncertainties for 19 commodity groups. In case of potentially mixed lots, it is appropriate to multiply the typical sampling uncertainties with a factor of 1.4. For the pre-marketing testing of compliance, the expanded combined uncertainty including the uncertainty of sampling and the reproducibility of analyses should be taken into account. It is recommended to establish an action limit, which is lower than the authorised maximum residue limit, for premarketing testing of pesticide residue concentrations in plant commodities. The application of an Excel macro facilitating the calculation is illustrated with practical examples

Accuracy of analytical standard solutions and the uncertainty in their nominal concentrations

In the last step of the analysis, the accuracy of analytical standard solutions has a decisive influence on the measurement results of pesticide residues, as well as all other chemical contaminants, and, in the case of actual concentrations differing from nominal ones, can result in a systematic error during the determination of sample components. Therefore, most of the laboratories who feel responsible for their results pay special attention to the preparation and storage of standard solutions, and to replenishing solvent losses due to possible evaporation, based on the mass measurements of vessels storing standard solutions before and after use. However, in our experience, much less attention than necessary is paid in practical work to monitoring the possible decomposition of individual active ingredients, and not appropriate statistical methods are used for the evaluation of the monitoring results. In our article, we present the standard preparation methods of two laboratories employing “good analytical practices”, analyze the uncertainties of the different steps, and make a recommendation for the preparation of the most accurate standard solutions

Az analitikai standard oldatok pontossága és a névleges koncentrációjuk bizonytalansága

Az analitikai standard oldatok pontossága a növényvédő szermaradék, de minden más kémiai szennyező mérési eredményét a vizsgálat utolsó lépésében döntően befolyásolja, és a minta komponenseinek meghatározása során a névlegestől eltérő aktuális koncentráció tekintetében folyamatosan szisztematikus hibát eredményez. A legtöbb, eredményeiért felelősséget érző laboratórium ezért különös figyelmet fordít a standard oldatok elkészítésére és tárolására, illetve az oldószer esetleges elpárolgásából adódó veszteség pótlására a standard oldatokat tároló eszközök tömegének használat utáni és használat előtti mérése alapján. Tapasztalataink szerint azonban a gyakorlati munkában a szükségesnél sokkal kisebb figyelmet fordítanak az egyes hatóanyagok esetleges bomlásának ellenőrzésére, illetve nem a megfelelő statisztikai módszert alkalmazzák az ellenőrzési eredmények értékelésére. Cikkünkben bemutatjuk két, „jó analitikai gyakorlatot” alkalmazó laboratórium standard készítési módszereit, elemezzük az egyes lépések bizonytalanságát és javaslatot teszünk a legpontosabb standard oldatok elkészítési módjára

Estimation of uncertainty of soil sampling and sample homogenization techniques for determination of pesticide residues

A környezet növényvédő szer szennyezésének fő forrása a talaj. A mért szermaradék koncentráció értelmezéséhez szükség van a mérési eredmény kombinált bizonytalanságának ismeretére. Az analitikai vizsgálati eredmények szóródását a várható érték körül számos tényező befolyásolja. Ezek közül a fő összetevők a mintavétel, mintaméret csökkentés, minta-homogenizálás és az analízis véletlen hibája. A mintavétel bizonytalanságára, illetve a szermaradékok eloszlására növényi minták esetében számos irodalmi adattal rendelkezünk, talajokra viszont alig van adat. Kutatómunkám során meghatároztam a talajok növényvédőszer-maradék tartalmának vizsgálatához alkalmazott minta-előkészítési módszerek hatékonyságát, megbecsültem az egyes minta-előkészítési eljárások relatív hibáját, az oldószeres extrakció reprodukálhatóságát, illetve a talajhoz kötött szermaradékok extrakciójának hatékonyságát. Mindezeken túl optimalizáltam, majd validáltam a szermaradékok talajból történő kinyeréséhez szükséges extraciós módszert, valamint a gázkromatográfiás meghatározást. Az így kapott módszerrel maghatároztam két, rendszeres mezőgazdasági gyakorlat szerint növényvédő szerrel kezelt napraforgótáblán gyűjtött, 15 cm mélyről vett 5 cm átmérőjű talajfuratokban a szermaradékok eloszlását. Az elemi minták (talajfuratok) alkotta alapsokaságból ismételt véletlen visszatevéses mintavételi eljárással, számítógépes makró segítségével összetett mintákat képeztem és meghatároztam a mintavétel bizonytalanságát 10, ill. 25 elemi mintából álló összetett minták esetén. Az eredmények alapján vizsgáltam, hogy a 〖CV〗_n=〖CV〗_1/√n összefüggés a magas szermaradék értékek felé erősen elnyújtott eloszlásokra is alkalmazható-e. Végül a talajfuratokban mért szermaradékok relatív gyakorisági eloszlását összehasonlítottam a kezelt talajokon termesztett sárgarépa és burgonya mintákban tapasztalt relatív gyakorisági eloszlásokkal, hogy megvizsgáljam, hogy a növényi minták esetében rendelkezésre álló sok ezer, a szermaradékok eloszlására vonatkozó, adattal és információval kiegészíthetőek-e a talajok esetén limitáltan rendelkezésre álló adatok annak érdekében, hogy a legpontosabb becslést kapjam az összetett talajmintákban várható mintavételi bizonytalanságára. Ismert mennyiségű 14C-atrazinnal kezelt talaj mintahányadok acetonos extrakciójának reprodukálhatóságát vizsgáltam és megállapítottam, hogy a hozzáadott anyag közel 100%-ban visszanyerhető CVE=0,54%-os reprodukálhatósággal. Azaz az eredmények tipikus variabilitásáért (70%-120%), illetve reprodukálhatóságáért (CVA = 5-20%) nem az extrakció, hanem a további lépések (tisztítás, bepárlás stb.) a felelősek. A minta-homogenizálás hatékonyságának vizsgálatát 5 különböző tulajdonságú talajmintával végeztem, melyek 1/25-részét 14C-atrazinnal kezeltem, majd a négy vizsgálandó módszer (kézzel történő keverés, őrlés, homogenizálás szárazjéggel illetve desztillált vízzel) egyikével homogenizáltam, végül acetonnal extraháltam. A legalacsonyabb átlagos relatív minta-homogenizálásból eredő bizonytalanságot (20 gramm mintahányad esetén a CVSp=4-7%) a desztillált víz jelenlétében történő homogenizálás eredményezte, melyet az összes vizsgált talajra alkalmasnak találtam. A talajhoz kötött szermaradékok extrakciójának hatékonyságát a leggyakrabban alkalmazott, termoionos illetve elektronbefogási detektorokkal kompatibilis oldószerekkel (aceton, etil-acetát illetve hexán) határoztam meg. A vizsgálatokhoz a különböző fizikai-kémiai tulajdonságú talajmintákat 14C-jelzett modellvegyületekkel kezeltem. Megállapítottam, hogy a vizsgált extrahálószerek közül a két lépcsős, acetonnal, majd etil-acetáttal történő extrakciós módszer a legalkalmasabb a különböző polaritású komponensek kinyerésére. A 14C-jelzett komponensek használatának nagy előnye, hogy koncentrációjuk a folyadék szcintillációs számlálóval (LSC) közvetlenül az extraktból mérhetőek, kisebb, mint 1% relatív bizonytalanság mellett. Az optimált módszert validáltam és ezzel a módszerrel meghatároztam a két növényvédő szerrel kezelt területen vett 5 cm átmérőjű 126-126 talajfurat szermaradék tartalmát abból a célból, hogy vizsgáljam a szermaradékok eloszlását, illetve a mintavétel bizonytalanságát. Az egyes talajfuratokban mért koncentrációk között 60-240-szeres különbségeket tapasztaltam. Megállapítottam, hogy a kezelt területen az egyedi talajfuratokban mért szermaradékok eloszlása 5 növényvédőszer-maradék talaj kombinációból származó adatsorból átlagosan 88%-os relatív szórással jellemezhető. A mintavétel bizonytalanságának meghatározásához az elemi talajfuratokban mért eredmények alkotta populációból ismételt véletlen visszatevéses mintavételi eljárással 10, illetve 25 elemszámú összetett mintákat képeztem számítógépes makró segítségével. Megállapítottam, hogy a 〖CV〗_n=〖CV〗_1/√n összefüggés a magas szermaradék értékek felé erősen elnyújtott eloszlásokra is alkalmazható, tehát az összetett minták átlagos szermaradék tartalma tetszőleges elemszámra számítható. A talajban termesztett növények (sárgarépa és burgonya) 14 kezelt területről vett elemi mintáiban mért szermaradék átlagos CVRzöldség értéke 99% volt. Az eredmények jó összhangban vannak a gyökér és gumós zöldségek elemi mintáiban 256 szerkísérlet alapján becsült CVR =103% értékkel. A talajfuratokban mért, valamint a kezelt talajokon termesztett sárgarépa és burgonya mintákban tapasztalt relatív gyakorisági eloszlásokat összehasonlítva megállapítottam, hogy azok nagyon hasonlóak és átfedik egymást, így hasonló variabilitást várható a talajfuratok, illetve a talajban termesztett termések szermaradéktartalma esetén. Figyelembe véve a fenti megállapításokat, javaslom a CVS=100% alkalmazását a talajokban mért szermaradékok eloszlásának jellemzésére, valamint a talajmintavétel bizonytalanságának becslésére. Amennyiben a talajfuratokban mért szermaradékok eloszlására több adat áll rendelkezésre, ez az érték a későbbiekben tovább finomítható. Vizsgálataim megerősítik, hogy a vonatkozó ISO-10381-1 mintavételi szabvány (ISO, 2002) által előírt 25 elemű minta vétele növényvédőszer-maradékok vizsgálatára is megfelelő, mert ez a mintaméret a legtöbb rutin laboratórium számára még jól kezelhető és így a mintavételből származó bizonytalanság is 20% körül tartható.N