Immune Responses to Pathogen Infection in Arabidopsis

To survive, plants must recognize the presence of danger and establish effective defenses against invading pathogens. Most plants are resistant to the majority of plant pathogens. This passive protection is provided primarily by the cell wall and waxy cuticular layer that limit the progress of most attackers. If these barriers are overcome, the second line of defense is triggered upon detection of pathogen-associated molecular patterns or damage-associated molecular patterns by pattern recognition receptors. The activation of PRRs induces multifaceted intracellular signaling pathways that ultimately initiate defense responses. Many molecular components by which plants perceive pathogens and the downstream signaling cascades have been characterized on a molecular level. However, the mechanisms by which plants protect themselves from phytopathogens (in particular necrotrophs) remain to be elucidated. Three aspects of plant immunity to phytopathogens are addressed in this thesis: (I) the role of glucosidase II β-subunit AtGCSIIβ in EFR receptor-mediated defense signaling, (II) the role of F-box protein AFB4 in plant innate immunity against necrotrophic pathogens, and (III) the role of class III peroxidases in cuticle formation that governs very strong and local resistance against necrotrophic bacterial and fungal pathogens. Plants exploit membrane-localized PRRs for specific and rapid detection of the potential pathogens. Many eukaryotic membrane-localized proteins undergo quality control during folding and maturation in the endoplasmic reticulum, a process termed endoplasmic reticulum quality control. The biogenesis of EFR, and to a lesser extent FLS2 receptors, is regulated by this mechanism. Study I demonstrated that the glucosidase II β-subunit AtGCSIIβ is pivotal for the function of the plant innate immunity receptor EFR. Loss-of-function in AtGCSIIβ results in elf18-insensitive phenotype, confirming the importance of AtGCSIIβ in biogenesis of the EFR receptor. F-box proteins are important components in plant hormone responses. They target regulatory proteins to the ubiquitin proteolytic machinery and mediate hormone signaling transduction. In study II, we demonstrated that auxin signaling F-box protein mutant plants are enhanced in their resistance to bacterial and fungal necrotrophic pathogens. This was accompanied with altered sensitivity to methyl jasmonate, indole-3-acetic acid, and abscisic acid phytohormones, thus providing evidence that ABF4-mediated signaling is involved in balancing growth and defense responses via coordination of hormone-mediated signaling pathways. The ability to maintain the barrier properties of the epidermis is largely due to the cell walls, which are covered with specialized lipids. This fine structure at the outermost region of the cell walls of epidermal cells is called the cuticle, which has been the subject of many studies. Plants perceive and ultimately activate defense mechanisms in response to cuticular and cell wall structural components e.g. oligogalacturonides released by the action of degradative enzymes secreted by pathogenic bacteria or fungi. Cuticle alterations induce a battery of reactions that often result in reactive oxygen species production and resistance to necrotrophic pathogens. However, the source of ROS generated upon altered cuticle status and the acute downstream defense signaling pathways involved in such defense remains elusive. Study III provides evidence that ROS produced by class III apoplastic peroxidases suppress the expression of cuticle-biosynthetic genes, and together with ABA, regulate the formation of the cuticle envelope. However, resistance to necrotrophic pathogens in cuticle-depleted plants is a result of activated OG signaling components and function independently of salicylic acid and jasmonic acid signaling pathways. This thesis demonstrates the use of Arabidopsis in studying the genetic basis of plant defense mechanisms. It provides novel insights on plant resistance to pathogens, and reveals how cuticular defects activate defense via OG signaling pathway.Selviytyäkseen kasvin on pystyttävä havaitsemaan sitä uhkaavien taudinaiheuttajien läsnäolo sekä kyettävä puolustautumaan niitä vastaan. Kasvit ovat yleensä vastustuskykyisiä suurimmalle osalle taudinaiheuttajista. Tämä passiivinen suoja on seurausta lähinnä kasvin soluseinän ja vahamaisen kutikulakerroksen muodostamasta mekaanisesta esteestä, jota suurin osa hyökkääjistä ei kykene läpäisemään. Joskus taudinaiheuttaja kuitenkin murtaa suojamuurin ja seuraava puolustuslinja aktivoituu. Tämä tapahtuu kasvin tunnistaessa taudinaiheuttajissa tyypillisesti esiintyviä molekyylirakenteita tai kasvista sen vaurioituessa irtoavia molekyylejä. Tunnistaminen tapahtuu näitä molekyylejä sitovien reseptorien avulla. Reseptorien aktivoituminen käynnistää solunsisäisiä signalointiketjuja johtaen lopulta puolustusvasteiden käynnistymiseen. Monet tunnistamiseen ja signalointiketjuihin osallistuvat molekyylitason komponentit tunnetaan, mutta mekanismit, joita kasvit käyttävät puolustautuessaan taudinaiheuttajia (etenkin nekrotrofeja) vastaan, ovat edelleen laajalti hämärän peitossa. Tämä väitöskirja käsittelee kolmea kysymystä liittyen kasvien vastustuskykyyn taudinaiheuttajia vastaan: (I) glukosidaasi II-entsyymin β-alayksikön (AtGCSIIβ) roolia EFR-reseptorivälitteisessä puolustussignaloinnissa, (II) F-box-proteiini AFB4:n roolia kasvin vastustuskyvyssä nekrotrofisia taudinaiheuttajia vastaan ja (III) luokan III peroksidaasien roolia tehokkaan paikallisen suojan nekrotrofisia taudinaiheuttajabakteereita ja sieniä vastaan tuottavan kutikulakerroksen muodostumisessa. EFR-reseptori on bakteereilla esiintyvän elongaatiofaktori Tu:n tunnistava kasvin solukalvolla sijaitseva proteiini. Monien kalvoproteiinien tavoin reseptorien on läpäistävä laadunvalvonta niiden laskostuessa ja kypsyessä solulimakalvostossa. Työssä I osoitettiin, että glukosidaasi II-entsyymin β-alayksikkö AtGCSIIβ on välttämätön toiminnallisen EFR-reseptorin synnylle. AtGCSIIβ:n puuttuessa kasvi ei reagoi elongaatiofaktori Tu:n läsnäoloon lainkaan. F-box-proteiineilla on tärkeä osa kasvien hormonivasteissa. Ne kohdentavat säätelijäproteiineja ubikitiinivälitteiseen proteiinien hajotuskoneistoon ja osallistuvat näin hormonivasteiden säätelyyn. Työssä II näytettiin, että auxin signaling F-box protein mutanttikasvin (afb4-1) vastustuskyky nekrotrofisia bakteeri- ja sienitaudinaiheuttajia vastaan on villityyppistä kasvia parempi. Lisäksi mutanttikasvien herkkyys metyylijasmonaattia, indoli-3-etikkahappoa ja abskissihappoa kohtaan on muuntunut, mikä osoittaa, että AFB4 toimii kasvin kasvun ja puolustusvasteiden välisen tasapainon säätäjänä koordinoimalla hormonivälitteisten signalointiketjujen toimintaa. Kasvin epidermi toimii suojamuurina ulkomaailmaa vastaan. Suoja on laajalti kutikulan eli epidermisolujen soluseinän lipidien peittämän uloimman kerroksen ansiota. Taudinaiheuttajabakteerit ja sienet erittävät entsyymejä, jotka hajottavat kutikulan ja soluseinän komponentteja. Entsyymien toiminnan seurauksena kutikulasta ja soluseinästä vapautuu niiden rakenteellisia osia kuten oligogalakturonideja, jotka kasvi tunnistaa signaaliksi vaarasta. Kutikulan vauriot käynnistävät joukon vasteita ja seurauksena on usein reaktiivisten happilajikkeiden tuotto ja vastustuskyky nekrotrofisia taudinaiheuttajia vastaan. Reaktiivisten happilajikkeiden lähdettä kutikulavasteessa tai siihen liittyvän signalointiketjun rakennetta ei kuitenkaan tunneta. Työssä III osoitettiin, että luokan III apoplastisten peroksidaasien tuottamat reaktiiviset happilajikkeet alentavat kutikulan muodostamiseen osallistuvien geenien ilmenemistä ja yhdessä abskissihapon kanssa säätelevät kutikulakerroksen rakentumista. Viallisen kutikulan omaavien kasvien vastustuskyky nekrotrofisia taudinaiheuttajia vastaan on puolestaan seurausta oligogalakturonidien aktivoimasta signaloinnista, eikä riipu salisyylihappo- tai jasmonihapposignaloinnista. Väitöskirja havainnollistaa lituruohon hyödyllisyyttä kasvin puolustusmekanismien perinnöllistä taustaa selvittävässä tutkimuksessa. Väitöskirja tarjoaa uusia ajatuksia kasvien vastustuskyvystä taudinaiheuttajia vastaan ja paljastaa, kuinka puutteet kutikulan rakenteessa johtavat puolustuksen aktivoitumiseen oligogalakturonidivälitteisen signaloinnin kautta

Peroxidase-Generated Apoplastic ROS Impair Cuticle Integrity and Contribute to DAMP-Elicited Defenses

Cuticular defects trigger a battery of reactions including enhanced reactive oxygen species (ROS) production and resistance to necrotrophic pathogens. However, the source of ROS generated by such impaired cuticles has remained elusive. Here, we report the characterization of Arabidopsis thaliana ohyl mutant, a Peroxidase 57 (PER57) - overexpressing line that demonstrates enhanced defense responses that result both from increased accumulation of ROS and permeability of the leaf cuticle. The ohyl mutant was identified in a screen of A. thaliana seedlings for oligogalacturonides (OGs) insensitive/hypersensitive mutants that exhibit altered growth retardation in response to exogenous OGs. Mutants impaired in OG sensitivity were analyzed for disease resistance/susceptibility to the necrotrophic phytopathogens Botrytis cinerea and Pectobacterium carotovorum. In the ohyl line, the hypersensitivity to OGs was associated with resistance to the tested pathogens. This PER57 overexpressing line exhibited a significantly more permeable leaf cuticle than wild-type plants and this phenotype could be recapitulated by overexpressing other class III peroxidases. Such peroxidase overexpression was accompanied by the suppressed expression of cutin biosynthesis genes and the enhanced expression of genes associated with OG-signaling. Application of ABA completely removed ROS, restored the expression of genes associated with cuticle biosynthesis and led to decreased permeability of the leaf cuticle, and finally, abolished immunity to B. cinerea. Our work demonstrates that increased peroxidase activity increases permeability of the leaf cuticle. The loss of cuticle integrity primes plant defenses to necrotrophic pathogens via the activation of DAMP-responses.Peer reviewe

Molecular Fingerprint and Developmental Regulation of the Tegmental GABAergic and Glutamatergic Neurons Derived from the Anterior Hindbrain

Tegmental nuclei in the ventral midbrain and anterior hindbrain control motivated behavior, mood, memory, and movement. These nuclei contain inhibitory GABAergic and excitatory glutamatergic neurons, whose molecular diversity and development remain largely unraveled. Many tegmental neurons originate in the embryonic ventral rhombomere 1 (r1), where GABAergic fate is regulated by the transcription factor (TF) Tal1. We used single-cell mRNA sequencing of the mouse ventral r1 to characterize the Tal1-dependent and independent neuronal precursors. We describe gene expression dynamics during bifurcation of the GABAergic and glutamatergic lineages and show how active Notch signaling promotes GABAergic fate selection in postmitotic precursors. We identify GABAergic precursor subtypes that give rise to distinct tegmental nuclei and demonstrate that Sox14 and Zfpm2, two TFs downstream of Tal1, are necessary for the differentiation of specific tegmental GABAergic neurons. Our results provide a framework for understanding the development of cellular diversity in the tegmental nuclei.Peer reviewe