The disintegrin echistatin in combination with doxorubicin targets high-metastatic human osteosarcoma overexpressing ανβ3 integrin in chick embryo and nude mouse models.

Echistatin, a cyclic RGD peptide, which is an antagonist of αvβ3 integrin (disintegrin), inhibited human osteosarcoma in the chick chorioallontoic membrane (CAM) model and tumor growth and pulmonary metastases in a nude mouse orthotopic model. A high-metastatic variant of human osteosarcoma, 143B-LM4, overexpressing αvβ3 integrin was used. Tumor angiogenesis by high-metastatic variant 143B-LM4 cells in the CAM was significantly inhibited by echistatin (P<0.05) as was overall growth. A doxorubicin (DOX)-echistatin combination inhibited orthotopic tumor growth compared to untreated control (P<0.01) or DOX alone (P<0.05) in nude mice. Tumor-bearing mice treated with the DOX-echistatin combination survived longer than those treated with DOX alone or control PBS (P<0.01 and P<0.01, respectively). Echistatin also inhibited experimental lung metastasis of 143B-LM4 cells in nude mice. These results suggest that DOX in combination with a disintegrin has potential to treat osteosarcoma and that αvβ3 integrin may be a target for osteosarcoma

Disintegrin targeting of an αvβ3 integrin-over-expressing high-metastatic human osteosarcoma with echistatin inhibits cell proliferation, migration, invasion and adhesion in vitro.

The in vitro efficacy of the disintegrin echistatin was tested on a high-metastatic variant of 143B human osteosarcoma, 143B-LM4, which over-expresses αvβ3 integrin. Echistatin is an RGD cyclic peptide and an antagonist of αvβ3 integrin. In the present study, echistatin inhibited cell proliferation, migration, invasion, and adhesion of 143B-LM4 cells. 143B-LM4 cell proliferation decreased after treatment with echistatin in a time-dependent and dose-dependent manner (P <0.01). In vitro migration and invasion of 143B-LM4 cells were also inhibited by echistatin in a dose-dependent manner (P <0.01, respectively). Cell adhesion to vitronectin of 143B-LM4 cells was also inhibited by echistatin in a dose-dependent manner (P <0.01). These results suggest that αvβ3 integrin may be an effective target for osteosarcoma

一日のうち一定時間に限り繰り返し暑熱暴露されたラットの体温調節反応

取得学位 : 博士（医学）, 学位授与番号 : 医博甲第1158号，学位授与年月日：平成7年3月25日,学位授与年：199

レプチン(obgene産生蛋白質)による体温の上昇は調節されたものか

金沢大学医薬保健研究域医学系レプチンはobgeneからつくられる蛋白質であり、ここ数年の間に生理薬理学的作用の一部が解明されてきた。レプチン欠損マウスの体温および熱産生量は正常マウスと比し有意に低くレプチンの抹消もしくは中枢投与で体温が上昇し熱産生量は増加する。これらの報告は、レプチンが体温調節に関与している可能性を示唆している。平成10年度にはレプチンが体温調節に強く関係することを報告した。本年度はレプチンの下流で働く因子を検討した。非拘束・正常ラットの皮下にシクロオキシゲナーゼ阻害薬のインドメタシンもしくは免疫抑制作用のあるデキサメサゾンを前投与し、一定時間を経た後ヒト-レプチンをラットの脳室内にマイクロインジェクションした。前投与後からの体温変化をテレメトリーシステムを用いて測定した。インドメタシンもしくはデキサメサゾンを前投与するとレプチンによる体温上昇は抑制された。また、インドメタシンはレプチンの摂食抑制に影響を与えないが、デキサメサゾンはレプチンの摂食減少を抑制した。上記の結果から、レプチンの体温上昇作用はプロスタグランジンやサイトカインを介していること、さらに、レプチンの摂食抑制はサイトカインを介していることが示唆された。研究課題/領域番号:10770025, 研究期間(年度):1998 – 1999出典：「レプチン(obgene産生蛋白質)による体温の上昇は調節されたものか」研究成果報告書　課題番号10770025（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-10770025/)を加工して作

G蛋白質共役型受容体スフィンゴシン-1-リン酸受容体の構造活性相関の解析

金沢大学医薬保健研究域医学系スフィンゴシン-1-リン酸(S1P)は細胞の遊走、形態変化、増殖など多彩な生理活性を示す脂質である。これまでに私たちはクローン化したS1P受容体(EDG1、EDG3、EDG5)を安定発現した培養細胞の解析から、(1)EDG1は主としてGi蛋白質を介してホスホリパーゼC(PLC)の活性化、Ras/MAPキナーゼの活性化、アデニル酸シクラーゼの抑制に共役していること、(2)EDG3はGq蛋白質を介してPLCの活性化、Gi蛋白質を介してRas/MAPキナーゼの活性化及びアデニル酸シクラーゼの抑制に共役していること、(3)EDG5はGq蛋白質を介してPLCの活性化、Gi蛋白質を介してRas/MAPキナーゼの活性化、Gs蛋白質を介してアデニル酸シクラーゼの活性化に共役していることを見出した。今回、S1P受容体の情報伝達に関わる分子内のドメインを明らかにするため、受容体の細胞内C末端領域を様々な長さに欠失させた変異体、および受容体サブタイプ間でキメラ体を作成し、それらの情報伝達能を検討した。その結果、野生型のEDG1はRacを活性化し、Rhoを活性化しなかった。一方、EDG5はRhoを活性化したが、Racを活性化しなかった。EDG1の第3細胞内ループおよび細胞内C末端領域をEDG5のそれに交換したキメラ体ではRacの活性化が消失した。EDG5の第3細胞内ループおよび細胞内C末端領域をEDG1のそれに交換したキメラ受容体はRhoの活性化を引き起こした。EDG1のRac活性化には第3細胞内ループおよび細胞内C末端領域が重要であること、一方EDG5のRho活性化には第3細胞内ループおよび細胞内C末端領域は必要ないことが示唆された。研究課題/領域番号:12770018, 研究期間(年度):2000-2001出典：「G蛋白質共役型受容体スフィンゴシン-1-リン酸受容体の構造活性相関の解析」研究成果報告書　課題番号 12770018（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-12770018/)を加工して作

生理活性脂質SlP受容体群Edgファミリーによる両方向性細胞運動制御の分子基盤

金沢大学医薬保健研究域医学系細胞運動は胎生期における器官・形態形成、生後においては炎症反応、癌の浸潤・転移、動脈硬化など様々な生理的・病的なプロセスに関与している。細胞運動は、生体では細胞遊走を正あるいは負に制御する種々の細胞外シグナル因子によって厳格に調節されている。スフィンゴシン-1-リン酸(S1P)は種々の細胞によって合成・放出され、血中に10^Mオーダーの濃度で存在する脂質メディエーターである。S1Pは血管内皮細胞に対して正の化学走化因子(ケモアトラクタント)として作用し、化学遊走を促進する。一方、ある種の癌細胞や血管平滑筋細胞に対しては負の化学走化因子(ケモリペラント)として作用し、化学遊走を抑制する。このことは、S1Pが生体内において細胞遊走の促進及び抑制の二方向性制御を及ぼしている可能性を示唆している。以前私達は、S1P受容体のうちS1P_1とS1P_3はともに細胞運動の分子スイッチと考えられる低分子量G蛋白質Racの活性を促進し、化学遊走を誘導するのに対し、S1P_2受容体は逆に細胞運動およびRac活性を抑制することを報告し、S1Pは異なる受容体サブタイプに作用することによってRac活性を二方向性に制御する結果、細胞遊走を正あるいは負に調節することを明らかにした。本研究では、S1P_2受容体によるRacの抑制にはRhoの活性化が必須であり、Rhoの上流には三量体G蛋白質G_及びG_が介在していることを証明し、細胞遊走の抑制性制御の分子基盤として、G_-Rho-Rac抑制という新規情報伝達経路を明らかにした。研究課題/領域番号:14770013, 研究期間(年度):2002-2003出典：「生理活性脂質SlP受容体群Edgファミリーによる両方向性細胞運動制御の分子基盤」研究成果報告書　課題番号14770013（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-14770013/)を加工して作

細胞遊走を負に制御する新規細胞内シグナルリング機構の探索

スフィンゴシン-1-リン酸(S1P)のユニークな生理活性としてS1P受容体サブタイプ依存的な二方向性細胞運動制御が挙げられる。我々は、S1P受容体の中でS1P1とS1P3はともにRacの活性を促進して化学遊走を誘導するが、逆に、S1P2は化学走化因子によるRac活性化を抑制して化学遊走を抑制すること、さらにS1P2によるRac抑制はG12/13-Rho情報伝達経路を介することを明らかにしてきた。平成16年度は、Rhoキナーゼ阻害薬や一部分のエフェクターとのみ相互作用する活性型RhoA二重変異体を用い、S1P2による細胞運動・Rac活性・アクチン骨格調節におけるRhoキナーゼの役割を検討した。Rhoキナーゼ阻害薬はS1P2によるstress fiber形成は抑制したが、Rac活性、細胞遊走およびラッフル膜形成は抑制しなかった。Rhoキナーゼと相互作用するV14-RhoAあるいはV14, C42-RhoAの発現はCHO細胞においてstress fiberを形成したが、Rhoキナーゼを活性化しないV14, A39-RhoAの発現はstress fiberを形成しなかった。これら3種類の活性型Rho変異体はいずれも、CHO細胞及びCOS7細胞の化学走化因子に対する化学遊走を抑制し、COS7細胞においてGTP結合型Rac1量を減少させた。以上の結果から、Rhoキナーゼの関与は否定的であった。平成17年度は、細胞遊走の抑制を来すRacの抑制が、Rhoのどのエフェクターを介して引き起こされるのかRNA干渉法を用いて同定を試みた。PKN1、PKN2、CRIK、mDia1、RhotekinのsiRNAのCHO細胞への導入により各Rhoエフェクターの蛋白質発現量が特異的に抑制されることをウエスタンブロット法で確認した。mDia1siRNAの細胞内導入はS1Pによるストレスファイバー形成を阻害した。しかしながら、上記siRNA各種を細胞内導入してもinsulin-like growth factor I(IGF-I)による細胞遊走、およびS1P2受容体を介したS1Pによる細胞遊走抑制には影響を与えなかった。また、Rhoキナーゼ阻害剤はS1Pによるストレスファイバー形成を抑制したが、S1P細胞遊走およびラッフル膜形成の抑制には影響しなかった。S1P2受容体によるRac活性・細胞遊走の抑制には、Rhoの活性化が必須である。RhoによるRacの抑制機序として、神経細胞やある種のリンパ細胞では、RhoエフェクターであるRhoキナーゼの関与が示されているが、私達の実験系(CHO細胞)では、Rhoキナーゼ阻害薬は無効であった。さらに、Rhoキナーゼ以外のRhoエフェクターのsiRNAの細胞内導入で特異的に該当蛋白質の発現量を抑制しても、S1P2受容体を介した細胞遊走抑制は阻害されなかった。これらの結果から、RhoによるRac活性の抑制が、未知のRhoエフェクターによるものか、エフェクターを介さずにRhoの直接の作用によるものか、また、既知のRhoエフェクターが複数関与するのか、等の可能性が考えられた。Sphingosine-1-phosphate (S1P) is a bioactive lysophospholipid that induces a variety of biological responses in diverse cell types. Many of these responses are mediated by S1P receptors, S1P_1/EDG1, S1P_3/EDG3, and S1P_2/EDG5. We previously showed that S1P_2/EDG5, via G_ and G_ proteins, mediated inhibiton of insulin-like growth factor-I (IGF-I)-induced Rac activation and cell migration, whereas S1P_1/EDG1 and S1P_3/EDG3 each alone, via G_1 protein, mediated Rac activation and stimulation of cell migration. However, it is not known how G_ and G_ proteins mediate inhibition of Rac and cell migration in S1P_2/EDG5 signaling. We found that the pretreatment with C3 toxin, which inactivates Rho, and the expresson of dominat negative Rho A prevented S1P_2/EDG5-mediated inhibition of Rac and cell migration. On other hand, the expression of constitutively active Rho inhibited IGF-I induced Rac activation and cell migration. However, Rho kinase inhibitors did not affect S1P_2/EDG5-mediated inhibition of Rac or cell migration. These results indicate that Rho, but not Rho kinase, mediates inhibition of Rac activity and cell mobility on stimulation of S1P_2/EDG5.研究課題/領域番号:16590163, 研究期間(年度):2004-2005出典：「細胞遊走を負に制御する新規細胞内シグナルリング機構の探索」研究成果報告書　課題番号16590163 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作

Calcium-dependent regulation of Rho and myosin phosphatase in vascular smooth muscle

Phosphorylation of 20 kD myosin light chain (MLC) is a critical process in eliciting smooth muscle contraction. Excitatory receptor agonists increase the extent of MLC phosphorylation by both activating myosin light chain kinase (MLCK) and inhibiting myosin phosphatase (MP). Activation of MLCK is dependent on Ca2+ and calmodulin, while inhibition of MP is dependent on the small guanosine triphosphatase Rho and Rho kinase. Receptor agonists were previously shown to induce Rho activation via the heterotrimeric G12/13 protein, largely in non-muscle cells. We recently discovered the novel Ca2+-dependent activation of Rho in vascular smooth muscle. This Ca2+-dependent Rho activation mechanism operates upon stimulation of vascular smooth muscle by either membrane depolarization or Gq-coupled vasoconstrictor receptors. Thus, Ca2+ induces MLC phosphorylation through both MLCK stimulation and MP inhibition. We found that phosphoinositide 3-kinase class II . isoform (PI3K-C2.) is involved in the Ca2+-dependent Rho activation and MP inhibition. PI3K-C2. appears to participate in regulation of vascular Rho activity and tone in vivo. These observations also indicate that PI3Ks exert isoform-specificeffectsonvasculartonethrough mechanisms involving regulation of endothelial nitric oxide production and smooth muscle MP activity.Biomedical Reviews 2005; 16: 13-21

Signaling mechanisms for positive and negative regulation of cell motility by sphingosine-1-phosphate receptors

Sphingosine-1-phosphate (S1P) exerts positive and negative effects on cell migration apparently in a cell-type-dependent manner. Our data suggest that the bimodal actions of S1P on cell migration is due to receptor subtype-specific positive and negative regulation of Rho family GTPase, Rac; S1P1 and S1P3 mediate Rac stimulation and chemotaxis whereas S1P2 mediates Rac inhibition and chemorepulsion. The stimulatory effects of S1P 1 and S1P3 on Rac and, subsequently on migration, are mediated by Gi. The inhibitory effect of SlP2 acts on G12/13 and Rho. S1P exerts inhibitory effects on some tumor cell migration and invasion via S1P2. S1P2 also mediates the inhibition of hematogenous metastasis. In contrast, exogenously expressed S1P1 has the reverse effect, it stimulates invasion and metastasis. S1P also exerts a similar bimodal action on vascular endothelial cells and, thereby, angiogenesis. The examples suggest that control of S1P receptor activity using a receptor subtype-specific agonist and antagonist may have beneficial effects on disorders, including cancer, and vascular diseases. © Springer-Verlag Tokyo 2006. All rights reserved.[Book Chapter] Y. Hirabayashi, Y. Igarashi, A.H. Merrill, Jr. (eds.), Sphingolipid biology, Springer-Verlag, c200