Obtención de compuestos bioactivos a partir de subproductos agroalimentarios: extracción, caracterización química y evaluación de su actividad frente a Alzheimer

El Alzheimer es una enfermedad causada por la neurodegeneración progresiva de la estructura y la función del cerebro, que provoca un deterioro de las actividades psicomotrices, los procesos cognitivos, el razonamiento, la memoria y el lenguaje y se exacerba durante el envejecimiento de los individuos. Esta enfermedad no sólo conduce al detrimento de la calidad de vida de quien la padece sino también de su entorno familiar debido al impacto afectivo y económico que representa. La variedad y complejidad de los factores detonantes de esta enfermedad ha impedido por el momento el hallazgo de una cura, por lo cual hasta la fecha, el Alzheimer, así como otras enfermedades neurodegenerativas, se considera progresiva e incurable y los tratamientos farmacológicos solo están enfocados a ralentizar el progreso o en atenuar los síntomas. Por esta razón, la prevención a través de hábitos saludables y componentes de la dieta, así como la búsqueda de tratamientos terapéuticos a base de productos naturales cobra una creciente importancia. En el presente trabajo de investigación se implementó un enfoque multianalítico para estudiar el efecto neuroprotector de fitoquímicos bioactivos presentes en residuos de dos cadenas alimentarias de importancia económica y social: las hojas de olivo (que corresponden aproximadamente al 25% de la biomasa producida en la cadena productiva del aceite de oliva (Olea europaea L.)) y el epicarpio de tamarillo (que representa entre el 8 y el 15% de un fruto tropical nativo de la región Andina de América del Sur, conocido como tamarillo o tomate de árbol (Cyphomandra betacea (Cav.) Sendt)). En relación con la hoja de olivo, numerosas publicaciones científicas han identificado los polifenoles como el grupo mayoritario dentro del total de compuestos presentes en este residuo. No obstante, esta importante biomasa también posee otros metabolitos minoritarios como los terpenos, que fueron los compuestos objetivo considerados en esta investigación. Se desarrolló un proceso dinámico de extracción con dióxido de carbono supercrítico (scCO2) acoplado a adsorción/desorción para lograr un fraccionamiento selectivo de los compuestos de interés. El estudio del comportamiento de diferentes adsorbentes comerciales en una cinética de extracción a 30 MPa, 60°C, flujo de solvente de 9 L/min CO2, cada 20 min hasta 120 min, permitió obtener fracciones enriquecidas en diferentes clases de terpenos de una manera selectiva. La naturaleza del adsorbente, su selectividad hacia determinadas familias de terpenos y el porcentaje de recuperación, fueron los parámetros analizados en el proceso de extracción. Tanto las fracciones que fueron eluyendo en los diferentes tiempos, como aquella que quedó retenida dentro del material adsorbente, se caracterizaron químicamente mediante la aplicación de técnicas analíticas avanzadas de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas de alta resolución (CG-Q-TOF-MS). Por otra parte, el potencial neuroprotector de todos los extractos se estudió a través de la capacidad inhibitoria de las enzimas colinérgicas (acetilcolinesterasa (AChE), butirilcolinesterasa (BChE)), de la enzima lipoxigenasa (actividad anti-inflamatoria), de la actividad antioxidante (ABTS•+) y la inhibición de especies reactivas de oxigeno (ROS) y de nitrógeno (RNS) a través de ensayos ORAC y radical óxido nítrico (NO•), respectivamente. Adicionalmente, para el extracto de hoja de olivo que presentó un mayor potencial neuroprotector, se llevó a cabo el estudio de la permeabilidad de sus compuestos mayoritarios a través de la barrera hematoencefálica y su toxicidad frente a las líneas celulares HK-2 y THP-1. Por otra parte, se evaluó la actividad del mencionado extracto en la línea celular humana de neuroblastoma SH-SY5Y, empleada como modelo in vitro para estudiar trastornos neurodegenerativos y, a través de un exhaustivo estudio lipidómico, se determinó el posible mecanismo molecular involucrado en la neuroprotección observada. Finalmente, la eficacia neuroprotectora de este extracto se confirmó en un estudio in vivo con una cepa transgénica de Caenorhabditis elegans (CL4176) modelo de Alzheimer que expresa el péptido β-amiloide humano. A través del proceso dinámico de extracción/adsorción/desorción se logró determinar que las sílicas favorecen la recuperación de mono y sesquiterpenos poliinsaturados; la alúmina promueve la retención de diterpenos, mientras que la naturaleza altamente cristalina de las zeolitas favorece la recuperación de triterpenos. Adicionalmente, el adsorbato obtenido a partir de la arena de mar fue el extracto que arrojó los resultados más promisorios en términos de neuroprotección, con valores de inhibición de las enzimas AChE y BChE (IC50= 144.43 y 183.82 µg/mL extracto, respectivamente), LOX (IC50= 104.82 µg/mL extracto), ABTS (IC50= 82.59 µg/mL extracto), ROS (IC50= 18.27 µg/mL extracto) y RNS (IC50= 1036.86 µg/mL extracto). Esta fracción no presentó toxicidad en las líneas celulares HK-2 y THP-1 a la concentración máxima de 40 µg/mL. El tratamiento aplicado en la línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y a la concentración máxima (40 µg/mL) permitió observar que el extracto seleccionado no altera la viabilidad celular, ejerciendo además un efecto protector frente al agente tóxico de Aβ42. La caracterización química de los extractos de hoja de olivo arrojó una identificación tentativa de 40 terpenos y terpenoides, los cuales se clasificaron de acuerdo con el número de isoprenos presentes en su estructura química. Dentro de los monoterpenos (C10) destacaron el cimenol y el timol; entre los sesquiterpenos (C15) los más abundantes fueron el γ-elemeno y el germacreno; mientras que el α-tocoferol, hexahidrofarnesil acetona y fitol fueron los diterpenos (C20) más representativos y el eritrodiol, uvaol, β-amirina y escualeno destacaron entre los triterpenos (C30). El estudio sugirió que el potencial neuroprotector de esta fracción es atribuible a la presencia de triterpenos altamente bioactivos, especialmente del grupo de los pentacíclicos, no obstante, se observó una mayor permeabilidad de los terpenos hexahidrofarnesil acetona, α-tocoferol y β-amyrin a través de la barrera hematoencefálica. El estudio lipidómico realizado a las células SH-SY5Y inoculadas con el péptido Aβ42 identificó más de 250 lípidos intracelulares; en aquellas células tratadas con el extracto de hoja de olivo enriquecido en triterpenos se evidenció un incremento en los niveles de fosfatidilcolinas y fosfatidiletanolaminas frente a las células control, lo cual sugiere un potencial efecto protector de los triterpenos y abren una ventana de oportunidad para futuras investigaciones en éste ámbito. Finalmente, la evaluación in vivo empleando una cepa transgénica de C. elegans estableció que a una dosis de 50 µg/mL se presentó el efecto protector más significativo del extracto frente a la parálisis de este gusano modelo de Alzheimer, superior al obtenido frente a un control positivo de un extracto de Ginkgo biloba a 100 μg/mL. Por otra parte, la extracción con líquidos presurizados (PLE) fue la técnica empleada para la obtención de compuestos fenólicos de interés a partir del epicarpio de tamarillo (TE). Un diseño central compuesto con superficie de respuesta determinó que el mayor contenido de fenoles (92.09 mg GAE/g extracto), flavonoides (4.40 mg Q/g extracto) y carotenoides (107.15 mg CE/g extracto) se obtuvo a unas condiciones óptimas de extracción de 15 MPa, 180 °C, 20 min y 100% EtOH como fase extractante. La caracterización química mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas de alta resolución (UHPLC-Q-TOF–MS/MS), identificó que los ácidos fenólicos del grupo de los hidroxicinámicos (cafeico, clorogénico y rosmarínico), flavonoides (quercetina y rutina) y carotenoides como el β-caroteno, eran los principales metabolitos responsables del potencial neuroprotector de la fracción optimizada, con valores de actividad inhibidora de las enzimas colinérgicas de AChE y BChE (IC50= 97.46 y 85.46 µg/mL extracto, respectivamente), LOX (IC50= 48.30 µg/mL extracto), ABTS (IC50= 6.33 µg/mL extracto), ROS (IC50= 2.54 µg/mL extracto) y RNS (IC50= 599.00 µg/mL extracto). Adicionalmente, esta fracción no exhibió toxicidad a concentración máxima de 120 µg/mL en las líneas celulares HK-2, THP-1 y de neuroblastoma SH-SY5Y. Los resultados derivados de estos trabajos realizados durante la Tesis Doctoral han dado lugar a 4 artículos de investigación originales publicados en revistas científicas internacionales del área de Ciencia y Tecnología de los Alimentos, además de 1 capítulo de libro.Esta Tesis Doctoral se ha realizado gracias a la financiación del proyecto AGL2017-89417-R “Revalorización, desde una perspectiva de biorrefinería, de terpenos procedentes de algas y subproductos agroalimentarios y evaluación Alimentómica de su actividad frente a Alzheimer” del Ministerio de Ciencia e Innovación de España y gracias también a la comisión de estudios otorgada por la Universidad de Nariño - Colombia.Peer reviewe

Neuroprotective Effect of Terpenoids Recovered from Olive Oil By-Products

The neuroprotective potential of 32 natural extracts obtained from olive oil by-products was investigated. The online coupling of supercritical fluid extraction (SFE) and dynamic adsorption/desorption allowed the selective enrichment of olive leaves extracts in different terpenoids’ families. Seven commercial adsorbents based on silica gel, zeolite, aluminum oxide, and sea sand were used with SFE at three different extraction times to evaluate their selectivity towards different terpene families. Collected fractions were analyzed by gas chromatography coupled to quadrupole-time-of-flight mass spectrometry (GC-QTOF-MS) to quantify the recoveries of monoterpenes (C10), sesquiterpenes (C15), diterpenes (C20), and triterpenes (C30). A systematic analysis of the neuroprotective activity of the natural extracts was then carried out. Thus, a set of in vitro bioactivity assays including enzymatic (acetylcholinesterase (AChE), butyrylcholinesterase (BChE)), and anti-inflammatory (lipoxidase (LOX)), as well as antioxidant (ABTS), and reactive oxygen and nitrogen species (ROS and RNS, respectively) activity tests were applied to screen for the neuroprotective potential of these extracts. Statistical analysis showed that olive leaves adsorbates from SS exhibited the highest biological activity potential in terms of neuroprotective effect. Blood–brain barrier permeation and cytotoxicity in HK-2 cells and human THP-1 monocytes were studied for the selected olive leaves fraction corroborating its potential

In vitro neuroprotective potential and lipidomics study of olive leaves extracts enriched in triterpenoids

Alzheimer's Disease (AD) is the most common form of dementia that is associated with extracellular amyloid beta (Aβ) plaque formation. Genetic, environmental, and nutrition factors have been suggested as contributors to oxidative stress and neuroinflammation events that are connected to AD etiology, and secondary metabolites, such as triterpenes, have shown promising results in AD prevention. In this work, the neuroprotective and anti-inflammatory potential of an olive leaves fraction enriched in triterpenoid compounds obtained using supercritical fluid extraction (SFE) and dynamic adsorption/desorption using sea sand as adsorbent has been performed. In addition, a comprehensive lipidomics study of the response of SH-SY5Y neuroblastoma cell line to this fraction was carried out using advanced analytical methodologies, namely, charged-surface hybrid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry (CSH-Q-TOF MS/MS). The use of freely available lipidomic annotation tools and databases, and stringent cut-off filters allowed the annotation of more than 250 intracellular lipids. Advanced bioinformatics and statistical tools showed a number of phosphatidylcholines and phosphatidylethanolamines significantly increased, which could explain the protection against the cell death caused by Aβ1–42. Moreover, several triacylglycerols were found decreased. These results suggest triterpenoids from olive leaves as good neuroprotective candidates, and open a new gate for future experiments using in vivo models to corroborate this hypothesis.This research was funded by the Ministry of Economy and Competitiveness (MINECO), Spain, project AGL2017-89417-R. ZS-M would like to acknowledge the University of Nariño (Colombia) for financial support. AV would like to acknowledge the Spanish Ministry of Science, Innovation, and Universities for his Juan de la Cierva post-doctoral grant (IJC2018-037560-I).Peer reviewe

Gas-Expanded Liquids Extraction

Gas Expanded Liquids (GXL) are mixtures of liquid solvents (organic, water) and gases or supercritical fluids with diverse physicochemical properties halfway between pure liquids and supercritical fluids. The possibility of changing their properties by introducing small changes in pressure, temperature, and/or solvent/gas ratio, makes these solvents a very interesting and appropriate option for developing green extraction protocols for food analysis. In general, GXLs have similar densities as the solvent used in their composition, while having improved mass transfer through reduced viscosity, increased solute diffusivity, and decreased interfacial tension. Some other advantages are related to the wide range of polarities that can be obtained, depending on the liquid selected. Moreover, the substitution of a liquid fraction for a gas reduces the final use of organic solvent, thus improving the green character of GXLs. In the present chapter, the physicochemical properties of GXL are addressed along together with the description of applications in the food science and technology area.Peer reviewe

Enhancement of the neuroprotective potential of olive leaf extracts though a selective fractionation strategy

Resumen del trabajo presentado al 6th PATh Spring Workshop: "A Path Towards Biomass Valorization Assisted by Green Chemistry Tools", celebrado en Aveiro (Portugal) el 30 de septiembre de 2021.This work was supported by the project AGL2017-89417-R (MINECO, Spain). Z.S.M. would like to acknowledge the University of Nariño (Colombia) for financial support. G.A.-R. would like to acknowledge the Ministry of Science and Innovation (MICINN, Spain) for a “Juan de la Cierva-Incorporación” postdoctoral grant IJC2019-041482-I.Peer reviewe

Extraction and mass spectrometric characterization of terpenes recovered from olive leaves using a new adsorbent-assisted supercritical CO2 process

This article belongs to the Special Issue Innovative Application of Mass Spectrometry in Food Analysis.This work reports the use of GC-QTOF-MS to obtain a deep characterization of terpenoid compounds recovered from olive leaves, which is one of the largest by-products generated by the olive oil industry. This work includes an innovative supercritical CO2 fractionation process based on the online coupling of supercritical fluid extraction (SFE) and dynamic adsorption/desorption for the selective enrichment of terpenoids in the different olive leaves extracts. The selectivity of different commercial adsorbents such as silica gel, zeolite, and aluminum oxide was evaluated toward the different terpene families present in olive leaves. Operating at 30 MPa and 60 °C, an adsorbent-assisted fractionation was carried out every 20 min for a total time of 120 min. For the first time, GC-QTOF-MS allowed the identification of 40 terpenoids in olive leaves. The GC-QTOF-MS results indicate that silica gel is a suitable adsorbent to partially retain polyunsaturated C10 and C15 terpenes. In addition, aluminum oxide increases C20 recoveries, whereas crystalline zeolites favor C30 terpenes recoveries. The different healthy properties that have been described for terpenoids makes the current SFE-GC-QTOF-MS process especially interesting and suitable for their revalorization.Z.J.S.M. would like to acknowledge the University of Nariño (Colombia) for financial support. G.Á.-R. acknowledges the Ministry of Economy and Competitiveness for a “Juan de la Cierva incorporación” postdoctoral grant (IJC2019-041482-I).Peer reviewe

Silymarin extraction for Silybum marinuim seeds using pressurized liquid extraction as a green and efficient technology

Resumen del trabajo presentado al Green Chemistry Postgraduate Summer School, celebrado en Venecia (Italia) del 4 al 9 de julio de 2021.Peer reviewe

Extraction of bioactives compounds from Silybum marianum using gas expanded liquid extraction

Resumen del póster presentado al 23rd International Symposium on Advances in Extraction Technologies (ExTech), celebrado on-line del 30 de junio al 2 de julio de 2021.For over then 2000 years, Milk thistle has been used as one of the most important medicinal plant as a remedy for liver disease. It has also been reported to have anti-tumor, anti-aging, antidiabetic, cardioprotective and neuroprotective effects. In 2019, milk thistle seed products placed in the 10th and 23rd in U.S. natural channel and U.S. mainstream multi‐outlet sales with more than $26 million. The aim of numerous studies has been to improve novel and efficient extraction techniques to produce high-quality extracts respecting the Green Chemistry Concepts. Among them, Gas-Expanded Liquids (GXLs) are the mixture between liquid solvents and pressurized compressible gas such us CO2. Thus, the objective of this work was to develop and evaluate the CO2 –expanded liquids (CXLs) as a new and green promising method for the extraction of bioactives such as Silymarin from Silybum marianum. Extraction solvent consisted on mixtures of CO 2 -Ethanol-water under different conditions, besides kinetic study was evaluated. The best yield reached 55.97% using a ternary mixture of solvents composed by Ethanol:CO2:H2O (60:25:15) at 40C° and 90bar in 160min. Moreover, the extracts obtained have been chemically and functionally characterized. HPLC-ESI-MS/MS (triple quadrupole) and invitro assays such as the anti-inflammatory and anti-cholinergic activities respectively.This work has been funded by the project AGL2017-89417-R (Spanish Ministry of Science and Innovation).Peer reviewe

Bioprospecting neuroprotective extracts from Algerian plants using green compressed fluid extractions

Resumen del póster presentado al 2º Iberian Meeting on Supercritical Fluids (2º Encuentro Ibérico de Fluidos Supercríticos/2º Encontro Ibérico de Fluidos Supercríticos - EIFS), held in Coimbra – Portugal, on 28 February- 2 March 2022.This work has been funded by the projects PID2020-113050RB-I00, PDC2021-120814-I00 and EQC2021-007112-P funded by MCIN/AEI /10.13039/501100011033 and The European Union Next GenerationEU/ PRTR respectively. N. Abderrezag are grateful to the Salah Boubnider Constantine 3 university, Constantine, Algeria for the fellowship.Peer reviewe

Potencial neuroprotector de productos naturales: una aproximación alimentómica con énfasis en lipidómica

Trabajo presentado al V Congresso de Óleos e Gorduras - International Meeting on Fats and Oils, celebrado en Brasil del 10 al 12 mayo de 2022.Peer reviewe