Ο ρόλος της κυτταρικής ανοσίας στη θεραπεία του καρκίνου

This dissertation aimed to investigate the potential role of the cytokine hetIL-15 (heterodimeric interleukin-15) as an immunotherapeutic drug for the treatment of breast and pancreatic cancer using murine cancer models that recapitulate the human diseases. IL-15 is a cytokine that has been shown to enhance the anti-tumor responses through the stimulation of several leukocyte populations of the cellular immunity, including cytotoxic CD8+ T lymphocytes and Natural Killer (NK) cells. Due to these properties, IL-15 has been suggested by the National Cancer Institute (NCI) as a promising immunotherapeutic drug for the treatment of cancer. Studies by Dr. Pavlakis’ lab revealed that the native form of IL-15 is a heterodimeric protein composed by the IL-15 molecule and the IL-15 receptor a (IL-15Rα) which is the in vivo active form of the cytokine in mice and humans. This complex is termed heterodimeric IL-15 (hetIL-15) and has an extended half-life and better efficacy compared to the recombinant single chain IL-15 produced in Escherichia coli. Here, the studies of hetIL-15 administration, systemically and peritumorally, in different mouse cancer models of breast (4T1 and EO771) and pancreatic (orthotopic, IV and transgenic KPC) cancer provide evidence of the strong anti-tumor and anti-metastatic potency of hetIL-15. Utilizing the 4T1 model of TNBC, hetIL-15 systemic administration exhibited strong anti-metastatic activity reducing the metastatic foci while increasing the cytotoxic effector cells (NK and CD8+ T cells) in the lung parenchyma of the tumor-bearing mice. hetIL-15 was found not only to reduce the metastasis in the lungs, but also to control the dissemination of circulating tumor cells (CTCs), resulting in improved therapeutic benefit in combination with chemotherapy and surgery. The data suggest that this anti-cancer response is achieved by the systemic expansion of CD8+T and NK cells and reduction of the immunosuppressive PMN-MDSCs (polymorphonuclear – myeloid derived suppressor cells) mediated by hetIL-15 monotherapy and enhanced by combination with chemotherapy. Importantly, 4T1 tumor resection accompanied by the pre- and post-surgery administration of hetIL-15 alone or in combination with doxorubicin led to the cure of approximately half of the animals and the establishment of immunological memory against 4T1 cancer cells. EO771 mouse model of triple negative breast cancer (TNBC) showed the highest sensitivity in hetIL-15 monotherapy upon peritumoral administration. The treatment led to complete tumor regression in 40% of the mice, extension of animal survival, induction of immunological memory against EO771 cancer cells and control of metastatic disease in the lungs. Immune phenotyping of the hetIL-15-treated EO771 primary tumor revealed that the cytokine reshaped the tumor microenvironment accumulating cytotoxic lymphocytes (NK and CD8+ T cells), conventional type 1 dendritic cells (cDC1s) and a novel dendritic cell population, defined as CD103intCD11b+DCs, which was found to correlate with EO771 tumor regression. Single-cell transcriptomic analysis revealed that this distinct DC population shares phenotypic and gene expression characteristics with both cDC1s and cDC2s and has transcriptomic profiles akin to monocyte derived DCs (moDCs). Similarly, systemic hetIL-15 monotherapy decreased the metastatic foci in the lungs of the orthotopic, intravenous and transgenic KPC model increasing the NK and CD8+ T cells in the organ without, however, extending animal survival due to insufficient control of the primary tumor. Although hetIL-15 monotherapy did not show a consistent control of the primary tumor growth, an extensive tumor necrosis was observed concurrently with a moderate increase in the frequency of cytotoxic cells (NK and CD8+ T cells) indicating anti-tumor activity. The novel CD103intCD11b+DC population was also found elevated in the pancreatic tumor upon hetIL-15 treatment. However, attempts to optimize the treatment schemes combining hetIL-15 with chemotherapy or targeted agents against mesothelin, a tumor associated antigen found increased in pancreatic cancer, were not found to be beneficial.The data presented in this study suggest that hetIL-15 is a promising cytokine for the treatment of TNBC and pancreatic cancer due to its anti-cancer and anti-metastatic properties. The reduction of the metastatic foci in the lungs and CTCs in the blood due to the systemic immune response against 4T1 tumor suggests that hetIL-15 may be a potent anti-metastatic therapy. The similar anti-metastatic effects of hetIL-15 treatment in the EO771 and KPC cancer models further support its anti-metastatic potential. Moreover, hetIL-15 treatment as a single agent or combined with chemotherapy in mice that underwent surgical excision of the 4T1 primary tumor, both pre- and post-surgery, resulted in favorable therapeutic outcomes with approximately half of the animals being cured. These findings suggest that hetIL-15 may be a promising treatment option for resectable breast cancer. Furthermore, hetIL-15 controls EO771 primary tumor growth by effectively coordinating a local immune response that leads to complete EO771 tumor regression. This potent anti-tumor activity is orchestrated by the activation of CD8+T and NK cells, as well as by the increase of tumor infiltration of cDC1 and CD103intCD11b+ DC subpopulation, which is a unique dendritic cell population, most closely related to moDCs. Although hetIL-15 did not show a major effect in delaying the pancreatic tumor, findings of anti-tumor activity were observed by the presence of extensive tumor necrosis and the accumulation of cytotoxic cells and the novel DC subpopulation. Overall, hetIL-15 anti-cancer effects on the TNBC and KPC mouse models, with the consistent anti-metastatic effect, holds promise for the future clinical use of the cytokine as a therapeutic agent against cancer. If these properties are successfully reproduced in humans, hetIL-15 may provide additional therapeutic options for breast and pancreatic cancer patients.Η παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματεύεται την αξιολόγηση της κυτταροκίνης hetIL-15 (heterodimeric interleukin-15 – ετεροδιμερής ιντερλευκίνη 15) ως ανοσοθεραπευτικού φαρμάκου για τη θεραπεία του καρκίνου του μαστού και του παγκρέατος χρησιμοποιώντας καρκινικά μοντέλα ποντικών που μιμούνται την ανθρώπινη νόσο. Η IL-15 είναι μια κυτταροκίνη που ενισχύει τις αντι-καρκινικές αποκρίσεις μέσω της ενεργοποίησης διαφόρων λευκοκυττάρων της κυτταρικής ανοσίας, συμπεριλαμβανομένων των κυτταροτοξικών CD8+ T λεμφοκυττάρων και των κυττάρων NK (Natural Killer – φυσικών φονέων). Λόγω αυτών των ιδιοτήτων, η IL-15 έχει προταθεί από το Εθνικό Αντικαρκινικό Ινστιτούτο (National Cancer Institute, NCI) των ΗΠΑ ως ένα αρκετά υποσχόμενο ανοσοθεραπευτικό φάρμακο για τη θεραπεία του καρκίνου. Μελέτες της ομάδας του Δρ. Παυλάκη αποκάλυψαν ότι η ενδογενής μορφή της IL-15 είναι μια ετεροδιμερής πρωτεΐνη που αποτελείται από το μόριο της IL-15 και τον IL-15 υποδοχέα α (IL-15 receptor a, IL-15Rα), η οποία αποτελεί την in vivo ενεργοποιημένη μορφή της κυτταροκίνης στα ποντίκια και τον άνθρωπο. Το σύμπλοκο ονομάζεται ετεροδιμερής IL-15 (hetIL-15) και έχει αυξημένο χρόνο ημίσειας ζωής και βελτιωμένη αποτελεσματικότητα σε σύγκριση με την ανασυνδυασμένη μορφή του μορίου της IL-15 που παράγεται από την Escherichia coli. Στην παρούσα διατριβή παρέχονται δεδομένα που αποδεικνύουν την ισχυρή αντι-καρκινική και αντι-μεταστατική δράση της IL-15 όταν χορηγείται με συστημικό τρόπο ή κοντά στον πρωτογενή όγκο σε μοντέλα ποντικών με καρκίνο του μαστού (μοντέλα 4T1 και EO771) και του παγκρέατος (ορθοτοπικό, ενδοφλέβιο και διαγονιδιακό KPC μοντέλο). Αξιοποιώντας το 4T1 μοντέλο του τριπλά αρνητικού καρκίνου του μαστού (triple negative breast cancer, TNBC) δείχθηκε ότι η συστημική χορήγηση της hetIL-15 έδρασε ως αντι-μεταστατικό φάρμακο μειώνοντας τη μετάσταση και αυξάνοντας τα κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα (NK και CD8+ T κύτταρα) στο παρέγχυμα του πνεύμονα των ποντικών που έφεραν τον 4T1 όγκο στο μαστό. Στο 4T1 μοντέλο, η hetIL-15 όχι μόνο μείωσε τη μετάσταση στους πνεύμονες, αλλά περιόρισε και τη διασπορά των καρκινικών κυττάρων στην κυκλοφορία (circulating tumor cells, CTCs) με αποτέλεσμα να ενισχύεται το θεραπευτικό αποτέλεσμα κατά το συνδυασμό της με τη χημειοθεραπεία και τη χειρουργική αφαίρεση του όγκου. Φαίνεται ότι η αντι-καρκινική αυτή δράση επιτυγχάνεται με τη συστημική αύξηση των CD8+T και NK κυττάρων και τη μείωση των ανοσοκατασταλτικών PMN-MDSCs (polymorphonuclear – myeloid derived suppressor cells, πολυμορφοπύρηνα ανοσοκατασταλτικά κύτταρα προερχόμενα από μυελώδη κύτταρα) που προκαλείται από τη μονοθεραπεία της hetIL-15 και ενισχύεται έπειτα από το συνδυασμό της με τη χημειοθεραπεία. Τέλος, η χειρουργική αφαίρεση του 4T1 πρωτογενούς όγκου συνοδευόμενη από τη χορήγηση της hetIL-15 ως μονοθεραπείας και συνδυαστικά με τη δοξορουβικίνη, προ-εγχειρητικά και μετεγχειρητικά, οδήγησε στην ίαση περίπου του μισού αριθμού των ζώων και την διατήρηση της ανοσολογικής μνήμης ενάντια στα 4T1 καρκινικά κύτταρα. Το δεύτερο προκλινικό μοντέλο του τριπλά αρνητικού καρκίνου του μαστού που εξετάστηκε ήταν το EO771, το οποίο έδειξε τη μεγαλύτερη ευαισθησία στη hetIL-15 μετά τη χορήγηση της κοντά στον πρωτογενή όγκο. Τα αποτελέσματα έδειξαν την πλήρη εξάλειψη του EO771 όγκου στο 40% των ποντικών, την επιμήκυνση της επιβίωσης των ποντικών, την επαγωγή της ανοσολογικής μνήμης ενάντια στα EO771 καρκινικά κύτταρα και την καταστολή της μετάστασης στους πνεύμονες. Η ανάλυση του ανοσολογικού φαινοτύπου του EO771 όγκου φανέρωσε ότι η κυτταροκίνη αναδιαμορφώνει το μικροπεριβάλλον του όγκου συναθροίζοντας τα κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα (NK και CD8+ T κύτταρα), τα κλασικά δενδριτικά κύτταρα τύπου 1 (conventional type 1 dendritic cells, cDC1s) και ένα ξεχωριστό πληθυσμό δενδριτικών κυττάρων, που ορίστηκε ως CD103intCD11b+DCs και βρέθηκε να συσχετίζεται με την εξάλειψη του EO771 όγκου. Η single-cell μεταγραφική ανάλυση αποκάλυψε ότι αυτός ο καινούριος τύπος δενδριτικών κυττάρων μοιράζεται φαινοτυπικά και γονιδιακά χαρακτηριστικά με τα δενδριτικά κύτταρα τύπου 1 και 2 (cDC1s and cDC2s) και έχει μεταγραφικά προφίλ παρόμοια με τα δενδριτικά κύτταρα που προέρχονται από τα μονοκύτταρα (monocyte derived DCs, moDCs). Ομοίως, η συστημική χορήγηση της μονοθεραπείας της hetIL-15 μείωσε τη μετάσταση στους πνεύμονες των ποντικών με παγκρεατικό καρκίνο, στο ορθοτοπικό, ενδοφλέβιο και διαγονιδιακό KPC προκλινικό μοντέλο, αυξάνοντας τα κυτταροτοξικά κύτταρα (NK και CD8+T) στο όργανο χωρίς ωστόσο να επιμηκύνει την επιβίωση των ζώων λόγω της μη επαρκούς καθυστέρησης της ανάπτυξης του πρωτογενούς όγκου. Αν και η hetIL-15 δεν έδειξε σταθερή δράση στην καθυστέρηση της ανάπτυξη του παγκρεατικού όγκου, παρατηρήθηκε εκτενής νέκρωση εντός του, με ταυτόχρονη μέτρια αύξηση των κυτταροτοξικών κυττάρων (NK και CD8+T) υποδεικνύοντας δράση κατά του όγκου. Επίσης, ο καινούριος πληθυσμός δενδριτικών κυττάρων, CD103intCD11b+DC, βρέθηκε αυξημένος εντός των παγκρεατικών όγκων μετά τη χορήγηση της hetIL-15. Ωστόσο, προσπάθειες να βελτιωθούν τα θεραπευτικά σχήματα συνδυάζοντας την hetIL-15 με χημειοθεραπεία ή στοχευμένη θεραπεία ενάντια στο σχετιζόμενο με τον παγκρεατικό καρκίνο μόριο της μεσοθηλίνης, δεν ευόδωσαν.Αυτή η διατριβή παρουσιάζει δεδομένα που προτείνουν την hetIL-15 ως μια υποσχόμενη κυτταροκίνη για τη θεραπεία του τριπλά αρνητικού καρκίνου του μαστού και του παγκρεατικού καρκίνου λόγω των αντι-καρκινικών και αντι-μεταστατικών ιδιοτήτων που επιδεικνύει. Η μείωση της μετάστασης στους πνεύμονες και των CTCs στο αίμα λόγω της συστημικής ανοσο-απόκρισης ενάντια στον 4T1 όγκο προτείνει ότι η hetIL-15 ίσως αποτελεί μια ισχυρή αντι-μεταστατική θεραπεία. Τα παρόμοια αποτελέσματα της αντι-μεταστατικής δράσης της hetIL-15 στα EO771 και KPC μοντέλα ενισχύουν περαιτέρω την πιθανή δυναμική της κυτταροκίνης ως αντι-μεταστατική θεραπεία. Επιπλέον, η μονοθεραπεία με hetIL-15 ή ο συνδυασμό της με χημειοθεραπεία σε ποντίκια που υποβλήθηκαν σε χειρουργική αφαίρεση του πρωτογενούς όγκου 4T1, τόσο πριν όσο και μετά τη χειρουργική επέμβαση, οδήγησε σε ευνοϊκά θεραπευτικά αποτελέσματα, με περίπου το ήμισυ των ζώων να θεραπεύονται. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η hetIL-15 μπορεί να αποτελέσει μια ελπιδοφόρα επιλογή θεραπείας για τον χειρουργήσιμο καρκίνο του μαστού. Επιπλέον, η hetIL-15 ελέγχει την ανάπτυξη του πρωτογενούς όγκου EO771, συντονίζοντας μια τοπική ανοσοαπόκριση που οδηγεί στην πλήρη εξάλειψη των EO771 όγκων. Αυτή η ισχυρή αντι-καρκινική δράση συντελείται μέσω της ενεργοποίησης των CD8+T και NK κυττάρων, καθώς και την αύξηση της εισροής του υποπληθυσμού cDC1 και CD103intCD11b+ DC εντός του όγκου. Ο CD103intCD11b+ DC είναι ένας διακριτός υποπληθυσμός δενδριτικών κυττάρων που σχετίζεται στενά με τα moDCs. Αν και η hetIL-15 δεν έδειξε μεγάλη δραστικότητα στον έλεγχο της ανάπτυξης του παγκρεατικού όγκου, εντοπίστηκε εκτενής νέκρωση του όγκου και συσσώρευση κυτταροτοξικών κυττάρων και του καινούριου πληθυσμού δενδριτικών κυττάρων, CD103intCD11b+ DC, που φανερώνουν δράση κατά του όγκου. Συνολικά, η αντικαρκινική δράση που επιδεικνύει η hetIL-15 στα προκλινικά TNBC και KPC μοντέλα καρκίνου, υπόσχεται τη μελλοντική κλινική χρήση της κυτταροκίνης ως θεραπείας κατά του καρκίνου. Εάν αυτές οι ιδιότητες αναπαραχθούν επιτυχώς σε ανθρώπους, η hetIL-15 μπορεί να παρέχει επιπλέον θεραπευτικές επιλογές για ασθενείς με καρκίνο του μαστού και του παγκρέατος

Heterodimeric IL-15 in Cancer Immunotherapy

Immunotherapy has emerged as a valuable strategy for the treatment of many cancer types. Interleukin-15 (IL-15) promotes the growth and function of cytotoxic CD8+ T and natural killer (NK) cells. It also enhances leukocyte trafficking and stimulates tumor-infiltrating lymphocytes expansion and activity. Bioactive IL-15 is produced in the body as a heterodimeric cytokine, comprising the IL-15 and the so-called IL-15 receptor alpha chain that are together termed “heterodimeric IL-15” (hetIL-15). hetIL-15, closely resembling the natural form of the cytokine produced in vivo, and IL-15:IL-15Rα complex variants, such as hetIL-15Fc, N-803 and RLI, are the currently available IL-15 agents. These molecules have showed favorable pharmacokinetics and biological function in vivo in comparison to single-chain recombinant IL-15. Preclinical animal studies have supported their anti-tumor activity, suggesting IL-15 as a general method to convert “cold” tumors into “hot”, by promoting tumor lymphocyte infiltration. In clinical trials, IL-15-based therapies are overall well-tolerated and result in the expansion and activation of NK and memory CD8+ T cells. Combinations with other immunotherapies are being investigated to improve the anti-tumor efficacy of IL-15 agents in the clinic

Tumor eradication by hetIL-15 locoregional therapy correlates with an induced intratumoral CD103intCD11b+ dendritic cell population

Summary: Locoregional monotherapy with heterodimeric interleukin (IL)-15 (hetIL-15) in a triple-negative breast cancer (TNBC) orthotopic mouse model resulted in tumor eradication in 40% of treated mice, reduction of metastasis, and induction of immunological memory against breast cancer cells. hetIL-15 re-shaped the tumor microenvironment by promoting the intratumoral accumulation of cytotoxic lymphocytes, conventional type 1 dendritic cells (cDC1s), and a dendritic cell (DC) population expressing both CD103 and CD11b markers. These CD103intCD11b+DCs share phenotypic and gene expression characteristics with both cDC1s and cDC2s, have transcriptomic profiles more similar to monocyte-derived DCs (moDCs), and correlate with tumor regression. Therefore, hetIL-15, a cytokine directly affecting lymphocytes and inducing cytotoxic cells, also has an indirect rapid and significant effect on the recruitment of myeloid cells, initiating a cascade for tumor elimination through innate and adoptive immune mechanisms. The intratumoral CD103intCD11b+DC population induced by hetIL-15 may be targeted for the development of additional cancer immunotherapy approaches