Clonage de l'ADNc du cytochrome P450aldo de hamster : Caractérisation enzymatique des cytochromes P450C11 et P450aldo

La stéroïdogénèse, ou la synthèse de stéroïdes hormonaux, est un processus qui débute par la transformation du cholestérol et qui se termine par la formation de nombreux produits comme l'aldostérone, le cortisol ou certains composés impliqués dans la différenciation sexuelle. Dépendant des espèces animales, les dernières étapes de la synthèse de l'aldostérone sont effectuées soit par un seul cytochrome, soit par deux cytochromes P450 différents. La présente étude démontre que chez le hamster, les dernières étapes menant à la synthèse de l'aldostérone à partir de la 11-désoxycorticostérone (DOC) sont catalysées par deux cytochromes P450 différents qui sont le P450c11 et le P450aldo. L'étude de la spécificité fonctionnelle de ces deux protéines s'est réalisée par la production de chacun des cytochromes dans des systèmes d'expression hétérologues afin d'écarter l'interférence de l'apport d'une enzyme sur l'activité de l'autre. L'ADNc du cytochrome P450c11 a été isolé d'une banque d'ADNc de surrénales de hamsters auquel ont été greffées les bases manquantes en extrémité 5' pour l'obtention de la partie codante complète. L'ADNc du cytochrome P450aldo a été amplifié à partir de l'ARNtotal isolé de surrénales de hamsters maintenues sous diète restreinte en sodium. Cette diète a pour effet d'activer in vivo l'expression de la protéine dans la zona glomerulosa du cortex surrénalien. Des amorces spécifiques ont permis l'amplification directe d'un ADNc complet par la méthode de RT-PCR. Des bactéries E.coli transformées avec le plasmide d'expression pKK223.3 contenant l'ADNc de P450aldo ont été capables de transcrire l'insert en ARN messager, mais l'apparition de la protéine dans les bactéries n'a pas pu être mise en évidence. Des essais similaires ont été repris en utilisant un système d'expression eucaryote. Des cellules COS-1 transfectées avec un plasmide arborant le cytochrome P450c11 ont transformé la [14C]DOC en [14C]corticostérone, [14C]190H-désoxycorticostérone et [14C]180H-désoxycorticostérone selon des proportions de 14:16:1 après 2 h d'incubation. Aucune synthèse d'[14C]aldostérone n'a été détectée dans le milieu de culture. Après des temps d'incubation plus élevés, la [14C]180H-corticostérone et la [14C]11-déshydrocorticostérone s'accumulaient graduellement dans le milieu pour atteindre des proportions significativement moindres que les autres produits. Les cellules COS-1 transfectées de façon à exprimer le cytochrome P450aldo ont transformé la [14C]DOC en [14C]corticostérone, [14C]aldostérone, [14C]180H-corticostérone, [14C]180H- ésoxycorticostérone, [14C]190H-désoxycorticostérone et [14C]11déshydrocorticostérone selon des proportions de 25:6:11:1:1:1 après 12 h d'incubation. Ces résultats indiquent qu'un P450 catalyse les dernières réactions de la formation des glucocorticoïdes alors qu'un autre P450 est impliqué dans les étapes finales menant à la synthèse de l'aldostérone dans les surrénales de hamster. La capacité que possède le P450c11 de hamster d'hydroxyler à la position C-11 et C-19 en proportion égale fait de cet animal un excellent modèle pour l'étude des mécanismes de synthèse et d'inhibition de la 190H-désoxycorticostérone, le précurseur de la 19nor-DOC, un minéralocorticoïde potentiellement impliqué dans le développement de l'hypertension essentielle

Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis.

The functions of many open reading frames (ORFs) identified in genome-sequencing projects are unknown. New, whole-genome approaches are required to systematically determine their function. A total of 6925 Saccharomyces cerevisiae strains were constructed, by a high-throughput strategy, each with a precise deletion of one of 2026 ORFs (more than one-third of the ORFs in the genome). Of the deleted ORFs, 17 percent were essential for viability in rich medium. The phenotypes of more than 500 deletion strains were assayed in parallel. Of the deletion strains, 40 percent showed quantitative growth defects in either rich or minimal medium.Journal ArticleResearch Support, Non-U.S. Gov'tResearch Support, U.S. Gov't, P.H.S.SCOPUS: ar.jinfo:eu-repo/semantics/publishe

Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome

Determining the effect of gene deletion is a fundamental approach to understanding gene function. Conventional genetic screens exhibit biases, and genes contributing to a phenotype are often missed. We systematically constructed a nearly complete collection of gene-deletion mutants (96% of annotated open reading frames, or ORFs) of the yeast Saccharomyces cerevisiae. DNA sequences dubbed 'molecular bar codes' uniquely identify each strain, enabling their growth to be analysed in parallel and the fitness contribution of each gene to be quantitatively assessed by hybridization to high-density oligonucleotide arrays. We show that previously known and new genes are necessary for optimal growth under six well-studied conditions: high salt, sorbitol, galactose, pH 8, minimal medium and nystatin treatment. Less than 7% of genes that exhibit a significant increase in messenger RNA expression are also required for optimal growth in four of the tested conditions. Our results validate the yeast gene-deletion collection as a valuable resource for functional genomics.Journal ArticleResearch Support, Non-U.S. Gov'tSCOPUS: ar.jinfo:eu-repo/semantics/publishe

Deletion of Many Yeast Introns Reveals a Minority of Genes that Require Splicing for Function

Splicing regulates gene expression and contributes to proteomic diversity in higher eukaryotes. However, in yeast only 283 of the 6000 genes contain introns and their impact on cell function is not clear. To assess the contribution of introns to cell function, we initiated large-scale intron deletions in yeast with the ultimate goal of creating an intron-free model eukaryote. We show that about one-third of yeast introns are not essential for growth. Only three intron deletions caused severe growth defects, but normal growth was restored in all cases by expressing the intronless mRNA from a heterologous promoter. Twenty percent of the intron deletions caused minor phenotypes under different growth conditions. Strikingly, the combined deletion of all introns from the 15 cytoskeleton-related genes did not affect growth or strain fitness. Together, our results show that although the presence of introns may optimize gene expression and provide benefit under stress, a majority of introns could be removed with minor consequences on growth under laboratory conditions, supporting the view that many introns could be phased out of Saccharomyces cerevisiae without blocking cell growth