Charakterisierung der Ausscheidung von L-Glutamat bei Corynebacterium glutamicum\textit{Corynebacterium glutamicum}

Mit Hilfe von $\textit{Corynebacterium glutamicum}$ werden jährlich 1,5 Millionen Tonnen L-Glutamat produziert. Dennoch konnte bislang weder ein L-Glutamat-Exporter identifiziert werden, noch ist genau verstanden, warum die Exkretion von L-Glutamat immer erst nach Induktion durch verschiedenste Auslöser erfolgt. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit fünf Methoden der Glutamatausscheidung etabliert und die genomweiten Genexpressionsmuster unter diesen Induktionsbedingungen quantifiziert. Durch die Auslöser der Glutamatausscheidung Ethambutol und Tween40 wurden 74 bzw. 137 Gene differentiell exprimiert, durch Biotin-Mangel und Penicillin aber nur 19 bzw. 18 Gene. Überraschenderweise zeigte sich kein Expressionsmuster, welches unabhängig von der Art der Induktion stets bei der Ausscheidung von L-Glutamat auftritt. Ebenso überraschend war, dass trotz stark verändertem Zentralstoffwechsel während der Ausscheidung von L-Glutamat keine veränderte Expression von Genen z.B. der Enzyme des Pentosephosphatwegs oder der α-Ketoglutarat-Dehydrogenase auftritt, was eher auf eine Regulation der Stoffflüsse auf Protein-, bzw. Aktivitätsebene schließen lässt. Es gab jedoch spezifische und teilweise sogar extreme Expressionsveränderungen. So führten Ethambutol und Tween40 zu einem bis zu 31-fach erhöhten mRNA-Spiegel von $\textit{mepA}$, das vermutlich für eine Metalloendopeptidase kodiert, und zu einem zweifach reduzierten mRNA-Spiegel von $\textit{accBC}$, welches für die α-Untereinheit der Acetyl-CoA-Carboxylase kodiert. Dies ist ein deutlicher Hinweis auf die Beeinflussung der Zellwandstruktur unter diesen Induktionsbedingungen. Auch das für einen mechanosensitiven Kanal der Osmoregulation kodierende $\textit{yggB}$ wurde durch Ethambutol und Tween40 bis zu vierfach verstärkt exprimiert. Durch zusätzliche Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass unabhängig von der Art der Induktion hyperosmotischer Schock die Exkretion drastisch reduziert, während hypoosmotischer Stress die Ausscheidung steigert. Aufgrund dessen ist anzunehmen, dass der noch zu identifizierende L-Glutamat-Exporter durch die Membranspannung in seiner Aktivität beeinflusst wird, worüber auch ein Zusammenhang mit der Zellwand als bekannter Wirkort der verschiedenen Auslöser der Glutamatausscheidung hergestellt werden könnte. Die genomweiten Expressionsanalysen ergaben, dass 13 Gene, die für putative Transporter und Membranproteine kodieren, nach Induktion der Glutamatausscheidung verstärkt exprimiert werden. Durch Inaktivierung konnte für die meisten dieser Gene gezeigt werden, dass sie weder die Ausscheidung von L-Glutamat noch das Wachstum beeinflussen. Diese Gene sind somit als nicht-essentiell zu betrachten. Die Inaktivierung des Gens $\textit{NCgl0944}$ führte zu einer deutlichen Reduktion der L-Glutamat-Exkretion nach Induktion durch Biotin- Mangel, Ethambutol und Penicillin. Eine weitere Mutante, in der das Gen $\textit{NCgl2566}$ deletiert war, exkretierte dagegen nach Induktion durch Tween40 kaum noch L-Glutamat. Aus den Ergebnissen kann geschlossen werden, dass diese zwei Transporter direkt oder indirekt in die Glutamatausscheidung involviert sind. Während der Temperatur-induzierten Glutamatausscheidung wurden die zwei benachbart liegenden Gene $\textit{NCgl2816}$ und $\textit{NCgl2817}$ verstärkt exprimiert. Es konnte gezeigt werden, dass diese Gene durch L-Lactat induziert werden und als Operon vorliegen. Enzymtests zeigten, dass $\textit{NCgl2817}$ für eine L-Lactat-Dehydrogenase kodiert. Das Enzym oxidiert L-Lactat Quinon-abhängig zu Pyruvat und weist einen K$_{m}$-Wert von 0,5 mM für das einzige Substrat L-Lactat auf. Die Analyse einer Inaktivierungsmutante ergab, dass dieses $\textit{lldD}$ genannte Gen die Verwertung von L-Lactat essentiell ist, wogegen das kotranskribierte Gen sehr wahrscheinlich die L-Lactat-Aufnahme katalysiert