Visualisierung phasentypisch exprimierter viraler Proteine des neurotropen Varicella-Zoster-Virus nach Mutagenese bakterieller artifizieller Chromosome

Das humanpathogene Varicella-Zoster-Virus (VZV) gehört zu den α-Herpesviren, verursacht bei der Primärinfektion die Windpocken (Varizellen) und kann nach Reaktivierung aus latenter Persistenz in sensorischen Ganglien die schmerzhafte Gürtelrose auslösen (Herpes Zoster). Diese Schmerzen können als postherpetische Neuralgie über lange Zeit andauern. Zum besseren Verständnis der VZV-Infektion sensorischer Neurone wurden verschiedene Proteine, die typischerweise während der Virus-Latenz exprimiert werden, mit dem grün fluoreszierenden Protein (eGFP) fusioniert, so dass diese Proteine nach der Virusinfektion in permissiven Zellen und in sensorischen Ratten-Neuronen sowie deren Axone beobachtet werden konnten. Zum Vergleich wurde auch das durch den Leserahmen ORF23 kodierte Kapsidprotein (23p) markiert, da dieses Protein nur bei der lytischen, permissiven Infektion gebildet wird. Für diesen Zweck wurde das als bakterielles artifizielles Chromosom (BAC) klonierte Genom des Wildtyp-VZV HJO eingesetzt. Das BAC kann aufgrund der zwischen die viralen Genomenden inserierten Anteile des F-Plasmids stabil in Bakterien gehalten und in der En passant-Mutagenese durch homologe Rekombination ohne sekundäre Veränderungen manipu¬liert werden. Fast alle geplanten rekombinanten Viren mit eGFP-Proteinfusionen kon¬nten in permissiven eukaryonten Zellen rekonstituiert werden. Die rekonstituierten Viren zeigten aber gegenüber dem Wildtyp-Virus eine deutlich reduzierte Replikation, was bei der 29p-GFP-Fusionsmutante besonders ausgeprägt war. Zur Bestimmung der Lokalisation der Fusionsproteine wurden die für VZV permissiven Zelltypen eingesetzt, nämlich primäre menschliche Fibroblasten und die humane Melanom-Zelllinie MeWo, und mit sensorischen Neuronen der Ratte verglichen. Die untersuchten Proteine zeigten während der lytischen Infektion in den permissiven MeWo-Zellen und Fibroblasten die erwarteten Lokalisationsorte und auch in infizierten sensorischen Neuronen kon¬nten diese bestätigt werden. In weiteren Experimenten wurde 65p, das als „axonales Leitprotein“ des VZV in Neuronen gilt, ebenfalls mit eGFP fusioniert. Damit gleichzeitig der Transport der viralen Kapside im Axon beobachtet werden konnte, wurde auch eine Doppelfusions-Mutante mit eGFP an 65p und dem monomeren rot fluoreszierenden Protein (mRFP) an 23p hergestellt. Durch die retrograde Infektion primärer senso¬rischer Neurone im Mikrofluss-Kammer-System sollte die Beteiligung des 65p am axo¬nalen Viruspartikel-Transport hinsichtlich der möglichen Kolokalisation von 23p mit 65p untersucht werden. Tatsächlich erwies sich der axonale Transport von 65p und des Kapsids (23p) als voneinander unabhängig. Somit war es in dieser Arbeit erstmals möglich, die Lokalisationsmuster und teilweise auch die Funktionen unterschiedlicher viraler Proteine nach der Infektion mit gezielten VZV-Rekombinanten des Wildtyp-Isolats HJO zu untersuchen.The human pathogen Varicella-zoster virus (VZV) belongs to the α-herpesviruses, causes chickenpox (varicella) upon primary infection, and can induce painful shingles (herpes zoster) after reactivation from latent persistence in sensory ganglia. This pain can persist as post-herpetic neuralgia over long periods. To better understand the VZV infection of sensory neurons, various proteins which are typically expressed during virus latency were fused with the enhanced green fluorescent protein (eGFP) in order to observe these proteins after virus infection in permissive cells and in sensory rat neurons as well as in their axons. For comparison, the capsid protein 23p encoded by open reading frame ORF23 was also tagged because this protein is only expressed during the lytic, permissive infection. For this purpose, the genome of wildtype VZV HJO, cloned as a bacterial artificial chromosome, was used. This BAC can be stably main¬tained in bacteria and can be manipulated by en passant mutagenesis and homo¬logous recombination without secondary changes due to the insertion of F-plasmid components between the genomic ends of the virus. Almost all the planned virus recombinants with eGFP protein fusions could be reconstituted in permissive eukaryotic cells. However, the reconstituted viruses showed a markedly reduced replication in contrast to wildtype virus, especially for the 29p-GFP-fusion mutant. For the deter¬mination of the localization of the fusion proteins, the VZV-permissive cell types were used, namely primary human fibroblasts and the human melanoma cell line MeWo, and compared to sensory neurons from rat. The investigated proteins showed the expected localization patterns during lytic infection in permissive MeWo cells and fibroblast which also could be confirmed in infected sensory neurons. In further experiments, the putative axonal guidance protein 65p for VZV in neurons was also fused to eGFP. In order to study simultaneously the axonal transport of virus capsids, a double mutant with eGFP fused to 65p and monomeric red fluorescent protein (mRFP) fused to 23p was generated. By the retrograde infection of primary sensory neurons in the microfluidic chamber system the participation of 65p in the axonal virus particle transport was investigated with respect to a possible colocalization between 23p and 65p. Actually, the axonal transport of 65p and the capsid (23p) turned out to be independent from each other. Taken together, the localization patterns and partially also the functions of various virus proteins were investigated for the first time after infection with targeted VZV recombinants of wildtype isolate HJO