Porcine endogene Retroviren als Risiko bei der Xenotransplantation?

Der Mangel an verfügbaren Allotransplantaten und deren notwendigen Bedarf für die Klinik, resultiert in der Entwicklung neuer Ansätze für die Therapie der betroffenen Patienten. Die Transplantation von tierischen Zellen, Geweben und Organen auf den Menschen, die sogenannte Xenotransplantation, wird dabei als eine vielversprechende Möglichkeit angesehen. Aus vielfachen Gründen werden zur Zeit Schweine als potentielle Spender von Xenotransplantaten favorisiert. Jedoch ist mit der Verwendung porciner Xenotransplantate das Risiko einer Übertragung von Mikroorganismen auf den humanen Rezipienten verbunden. Dabei wird vermutlich das größte Risiko von den porcinen endogenen Retroviren (PERVs) ausgehen, welche mit über 50 Proviren an zahlreichen Loci im porcinen Genom integriert sind. Im Gegensatz zu den anderen bekannten Mikroorganismen des Schweins gelingt es momentan noch nicht, die PERVs aus dem Schwein zu eliminieren. PERVs gehören in die Gruppe der Gammaretroviren und sind nahe verwandt mit den Leukämieviren der Maus (MuLV) und der Katze (FeLV), welche neben der Verursachung von Leukämien auch Tumore und Immundefizienzen hervorrufen. Für mindestens zwei Subtypen der PERVs konnte gezeigt werden, daß sie humane Zellen in vitro infizieren. Die Transplantation porziner Organe auf den Menschen beinhaltet daher das Risiko einer Übertragung dieser Viren. Aus diesem Grund wurde im Rahmen der vorliegenden Promotionsarbeit einerseits das Spektrum infizierbarer humaner Zellen untersucht und näher charakterisiert, andererseits Zellen verschiedener Spezies mit Hinblick auf die Etablierung eines Tiermodells auf ihre Suszeptibilität gegenüber einer Infektion mit PERVs getestet. Dabei konnte eine Vielzahl von primären humanen Zellen und Zell-Linien unterschiedener Gewebe produktiv mit PERVs infiziert werden, was darauf hindeutet, daß es im humanen Organismus ein weites Spektrum PERV-suszeptibler Zellen gibt. In diesem Zusammenhang konnte erstmals gezeigt werden, daß sich PERVs an humane Zellen adaptieren. Die serieller Passagierung von PERVs auf humanen 293 Zellen resultierte dabei in einer gesteigerten Replikation der Viren, welche auf genetische Modifikationen in der U3-Region der LTRs zurückgeführt werden konnten. Diese Modifikationen beruhten auf einer Multimerisierung von repetitiven Sequenzen, welche Motive einer Transkriptionsfaktorbindestelle des Transkriptionsfaktors NF-Y enthalten. Dieser ubiquitär vorkommende Transkriptionsfaktor scheint wesentlich dazu beizutragen, daß sich die Viren in den unterschiedlichsten humanen Geweben effizient vermehren können. Für die Evaluierung des Risikos einer Übertragung von PERVs im Rahmen einer Xenotransplantation ist das Infektionspotential von PERVs in vivo von besonderem Interesse. Für die Untersuchung dieses Transmissionsrisikos in vivo wurden verschiedene Kleintiermodelle etabliert, indem naive Ratten, Cyclosporin-A (Cs-A) und Cobra Venom Faktor (CVF) immunsupprimierte Ratten, Meerschweinchen und Nerze mit PERVs inokuliert wurden. Bei keinem der Tiere konnte drei Monate nach der Virus-Applikation eine Antikörperproduktion gegen PERVs, sowie eine Integration proviraler DNA in das Genom verschiedener Gewebezellen beobachtet werden. Des Weiteren wurde ein Tiermodell mit nicht-humanen Primaten etabliert, in welchem ein „worst case scenario“ mit starker Virusfreisetzung nach einer Xenotransplantation simuliert wurde. Um die Situation einer klinischen Xenotransplantation widerzuspiegeln, wurden die nicht-humane Primaten täglich pharmakologisch mit einer Dreifachkombination aus Cs-A, dem Rapamycin-Derivat RAD und Prednisilon imunsupprimiert. Den Tieren wurden hohe Titer an zellfreiem Virus inokuliert, wobei einige Tiere zusätzlich zellassoziiertes Virus in Form von PERV-produzierenden Zellen erhielten. Bei keinem der Tiere ließen sich während des Zeitraumes von einem Jahr freie Virionen oder eine Antikörperbildung gegen PERVs im Serum nachweisen, sowie eine Integration von PERV proviraler DNA in Blutzellen oder Zellen anderer Gewebe detektieren. Die Daten dieser in vivo Studie stehen damit den Ergebnissen von vorausgegangenen in vitro Untersuchungen dieser Arbeit gegenüber, in welchen erstmals die produktive Infektion von primären Zellen der nicht-humaner Primaten gezeigt werden konnte. Da es zu keiner Infektion der Tiere in vivo gekommen ist, obwohl Zellen der selben Tiere für PERV in vitro suszeptibel sind, obwohl eine starke Immunsuppression appliziert wurde und obwohl hohe Titer von PERV inokuliert wurden, bleibt zu vermuten, daß das natürliche Immunsystem der Tiere ausgereicht haben muß, das inokulierte Virus effizient zu eliminieren. Für eine abschließende Einschätzung des Risikos einer Transmission von PERV im Rahmen einer Xenotransplantation, und die daraus eventuell resultierenden Folgen für den Xenotransplantatempfänger und die Gesellschaft, sind daher intensive weitere Untersuchungen auf diesem Gebiet notwendig, um vor der klinischen Realisierung der Xenotransplantation eine ausreichende Virussicherheit der porcinen Xenotransplantate gewährleisten zu können

Characterisation of a human cell-adapted porcine endogenous retrovirus PERV-A/C.

Background: Porcine endogenous retroviruses (PERVs) pose a potential risk for xenotransplantation using pig cells, tissues or organs. A special threat comes from viruses generated by recombination between human-tropic PERV-A and ecotropic PERV-C. Serial passages of a recombinant PERV-A/C on human 293 cells resulted in increased infectious titers and a multimerization of transcription factor binding sites in the viral long terminal repeat (LTR). In contrast to the LTR, the sequence of the env gene did not change, indicating that the LTR represents the determinant of high infectivity. Material/Methods: The virus was further propagated on human cells and characterized by different methods (titration, sequencing, infection experiments, electron microscopy). Results: Further propagation on human 293 cells resulted in deletions and mutations in the LTR. In contrast to low-titer viruses, the high-titer virus was infectious for cells from non-human primates including chimpanzees. Scanning electron microscopy revealed clustering of budding virions at the cell surface of infected human cells and transmission electron microscopy indicated that the virus infects them via receptor-mediated endocytosis. Conclusions: After propagation of PERV on human cells without selection pressure, viruses with different LTR were generated. High titer PERV was shown to infect cells from non-human primates. The experiments performed here simulate the situation in vivo and give an extended characterization of human cell-adapted PERVs

Genetic alterations of the long terminal repeat of an ecotropic porcine endogenous retrovirus during passage in human cells

AbstractHuman-tropic porcine endogenous retroviruses (PERV) such as PERV-A and PERV-B can infect human cells and are therefore a potential risk to recipients of xenotransplants. A similar risk is posed by recombinant viruses containing the receptor-binding site of PERV-A and large parts of the genome of the ecotropic PERV-C including its long terminal repeat (LTR). We describe here the unique organization of the PERV-C LTR and its changes during serial passage of recombinant virus in human cells. An increase in virus titer correlated with an increase in LTR length, caused by multiplication of 37-bp repeats containing nuclear factor Y binding sites. Luciferase dual reporter assays revealed a correlation between the number of repeats and the extent of expression. No alterations have been observed in the receptor-binding site, indicating that the increased titer is due to the changes in the LTR. These data indicate that recombinant PERVs generated during infection of human cells can adapt and subsequently replicate with greater efficiency

No in vivo infection of triple immunosuppressed non-human primates after inoculation with high titers of porcine endogenous retroviruses

Background: Porcine endogenous retroviruses (PERVs) released from pig tissue can infect selected human cells in vitro and therefore represent a safety risk for xenotransplantation using pig cells, tissues, or organs. Although PERVs infect cells of numerous species in vitro, attempts to establish reliable animal models failed until now. Absence of PERV transmission has been shown in first experimental and clinical xenotransplantations; however, these trials suffered from the absence of long-term exposure (transplant survival) and profound immunosuppression. Methods: We conducted infectivity studies in rhesus monkeys, pig-tailed monkeys, and baboons under chronic immunosuppression with cyclosporine A, methylprednisolone, and the rapamycin derivative. These species were selected because they are close to the human species and PERVs can be transmitted in vitro to cells of these species. In addition, the animals received twice, a C1 esterase inhibitor to block complement activation before inoculation of PERV. In order to overcome the complications of microchimerism, animals were inoculated with high titers of cell-free PERV. In addition, to enable transmission via cell–cell contact, some animals also received virus-producing cells. For inoculation the primate cell-adapted strain PERV/5° was used which is characterized by a high infectious titer. Produced on human cells, this virus does not express alpha 1,3 Gal epitopes, does not contain porcine antigens on the viral surface and is therefore less immunogenic in non-human primates compared with pig cell-derived virus. Finally, we present evidence that PERV/5° productively infects cells from baboons and rhesus monkeys. Results: In a follow-up period of 11 months, no antibody production against PERV and no integration of proviral DNA in blood cells was observed. Furthermore, no PERV sequences were detected in the DNA of different organs taken after necropsy. Conclusion: These results indicate that in a primate model, in the presence of chronic immunosuppression, neither the inoculation of cell-free nor cell-associated PERV using a virus already adapted to primate cells results in an infection; this is despite the fact that peripheral blood mononuclear cells of the same animals are infectible in vitro